第9章亲和纯化技术概要1.ppt

* 吸附：pH在6~8。 洗脱：降低pH值、增加离子强度、或在缓冲液中加5mmol/L EDTA等方法。 特点： 蛋白质吸附容量大； 价格便宜； 具有普遍适用性。 * （二）、有机染料亲和层析 有机染料具有类似于NAD+的结构。 需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。 染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。 染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。 * 亲和层析 一 、原理 二 、亲和层析载体 三 、亲和配基 四 、载体的活化与偶联 五 、影响吸附亲和力的因素 六 、配基与间隔臂的连接 七 、亲和层析的吸附和洗脱 八、其他亲和层析 * 第二节 其他亲和纯化技术 一、亲和过滤（膜分离） 二、亲和分配（双水相萃取） 三、亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 四、亲和沉淀（沉淀分级） 五、亲和电泳（电泳） * 一、 亲和过滤（Affinity Filtration） 将亲和层析和膜过滤技术结合运用，包括亲和错流过滤和亲和膜分离。 亲和错流过滤（affinity Cross Flow Filtration,ACFF）: 是将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。 * 亲和错流过滤 （affinity Cross Flow Filtration） 基质及大分子亲和配基 基质是聚合物组成的内核，亲和配基连接在内核表面。配基对提取的目标物进行专一可逆的吸附，形成复合体； 用膜对混合液进行错流过滤，复合体因分子巨大可被保留，杂质随液体透过膜，目标物与其它成分分离。 * 基质 聚丙烯酰胺 菌类的完整细胞 （酵母、芽胞杆菌、链球菌等细胞） 琼脂糖、脂质体等 酵母细胞纯化伴刀豆球蛋白A * 亲和膜 （affinity membrane） 亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。 将一张微滤膜比喻为一个固定床，膜厚为床层高度。 * 亲和膜优点 传质阻力小，达到吸附平衡的时间短； 配基利用率高，配基用量低； 压降小，流速快； 设备体积小。 * 二、亲和萃取  （Affinity extraction） 定义：利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取，在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相（上相）的分配，提高目标产物的分配系数和选择性。 PEG/Dextran, PEG/无机盐 * mA目标分子的亲和分配系数 T和B分别表示上相和下相； mA和m O为有、无配基时目标分子的分配系数； m L为配基的分配系数； CL为配基浓度； Kd为配基与目标分子反应的解离常数。 上相配基浓度CLT越高，m A越大 * 亲和萃取纯化过程 亲和分配（进料）， 杂蛋白反萃取（清洗） 目标产物反萃取（洗脱）。 * 三、亲和反胶团萃取（Affinity-based  reversed micellar extraction） 定义：指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外，添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂（cosurfactant）； 通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配。 * 亲和反胶团萃取过程 * 反萃取 * 四、亲和沉淀 （Affinity precipitation） 亲和沉淀:是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的生物大分子的分离纯化技术。 一次作用亲和沉淀 二次作用亲和沉淀 * 一次作用亲和沉淀 水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基 双配基（bis-ligand）；多配基（polyligand）。 双配基或多配基与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，增大为较大的交联网络而沉淀。 * 二次作用亲和沉淀 制备亲和沉淀介质:利用在物理场改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基。 亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。 沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。 * 可逆沉淀性聚合物 —聚丙烯酰胺 * 可逆沉淀性聚合物——聚合脂质体（polymerized liposome,PLS） * 亲和沉淀纯化技术优点 （1）溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快； （2）亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； （3）离心或过滤技术回收沉淀，规模放大； （4）可用于高粘度或含微粒料液中目标产物纯化。 * 五、亲和电泳（Affinity Electrophoresis） 亲和电泳是将亲和层析与电泳技术结合起来，将