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石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极 易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES 、ZLI-9003 HistogripTM 或ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂，对 已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50 比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮 去未结合的 APES ，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意 组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50 比例丙酮稀释的Histogrip 液中，停留1~2 分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10 比例去离子水稀 释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡 5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温 过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40 分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4% ，消化时间为37℃、30~180 分 钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin （层粘蛋白），Collagen IV （IV 型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin ）：一般使用浓度为2~10#61549;g/ml 的saponin 溶液，消化时间为室温孵育30 分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或 水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如 TBS 、PBS、 重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0 ） 效果最好。请选用我公司提供的 ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂） 配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH 值在6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH 值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3 ％H2O2 处理10 分钟，蒸馏水洗2 分钟×3 。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液 （工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃ ~98 ℃之间并持续10~15 分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉， 请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的 要求）。取出容器，室温冷却 10~20 分钟（注意：不可将切片从缓冲 液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS 洗，下 接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将 1500ml~3000ml 的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加 热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖 锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热 5~6 分钟后），计时 1~2 分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅 盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS 洗 2 分钟×3，下接免疫组化染色 步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛 有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数 量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达 92 ℃ ~98 ℃起开始计时15~20 分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30 分钟， 蒸馏水冲洗，PBS 洗，下接免疫组化染色步骤。 4 、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED 公司SP 试剂盒为例） 4.1 石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2 室温孵育5~10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5 分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后 进行)。 4.4 5~10 ％正常山羊血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育10 分钟。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4 ℃过夜。 4.5 PBS 冲洗，5 分钟×3 次。 4.6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-P