1.3Westernblot检测RPE细胞中DDR2、HIF-1α表达.docVIP

1.3　Western blot检测RPE细胞中DDR2、HIF-1α的表达 收集各组RPE细胞，裂解细胞提取总蛋白并定量，Western blot检测DDR2、HIF-1α的表达。每孔上样量20μg，SDS凝胶分离，电转移至NC膜。山羊抗人DDR2单克隆抗体（1500，Santa cruz）检测RPE细胞中DDR2的表达，小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体（Chemicon公司），小鼠抗人β-actin　单克隆抗体（1:500，Sigma公司）作为内参照。用荧光素标记的二抗（发光抗体）大鼠抗山羊IgG－HRP　（1:200000，Takara）、大鼠抗小鼠IgG－HRP　（1:200000，Takara）二抗结合一抗，暗室曝光显影。Ｘ光片扫描后，采用Bandscan5.0对目的条带灰度值定量。各个时间点的DDR2、HIF-1α灰度值与自身actin灰度值之比以±ｓ表示，并以此绘图描述缺氧状态下RPE细胞中DDR2、HIF-1α表达的变化。 1.4　RT-PCR检测RPE细胞中DDR2、HIF-1α，VEGF的表达 收集各组RPE细胞提取总RNA并定量，用逆转录试剂盒（Takara）合成cDNA。DDR2、HIF-1α，VEGF及GAPDH引物由上海生工全程合成，以cDNA为模板进行PCR扩增。所得各PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪分析成像，Bandscan5.0软件进行