喷他脒增强K562细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡敏感性.pdfVIP

刘小珊，等．喷他脒增强K562细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡敏感性 清，青、链霉素各1o0 U／ml的RPMI一1640培养液， 10 g／ml喷他脒分别作用细胞24 h和200 ng／ml 在37 ，饱和湿度，5％CO：培养箱中培养，每3～ TRAIL单独作用细胞4 h的细胞凋亡数为5．7％， 4 d换液传代。 7．8％和6．8％；预先用5、10 g／ml喷他脒作用细胞 1．2 药物处理 喷他脒购自Sigma公司；TRAIL 20 h后继用200 ng／ml TRAIL作用4 h，细胞凋亡数 购自PeproTech EC公司，用去离子分别水配制成10 分别是13．6％和31．2％(见图2)。 mg／n~和1 mg／n~的储存液，置一20 备用。收集 对数生长期细胞，调节细胞数为1 X 10 ／ml，取10 ml至培养皿中，分别加入不同终浓度的的喷他脒 作用K562细胞20 h后继用200 ng／ml TRAIL处理 4 h。对照组包括无药物处理组，喷他脒与TRAIL单 独处理组。上述细胞培养条件完全一致。37 培 养，收集细胞。 1．3 细胞形态学分析 利用OLympus光学显微镜 观察上述各种活体细胞形态。 1．4 Annexin V FITC／PI双标记的凋亡细胞的流式 细胞仪(FACS)测定 采用AnnexinV凋亡试剂盒 (南京凯基生物科技发展有限公司)，具体操作按说 明书进行。 1．5 细胞总蛋白提取与蛋白印迹 采用4 ， 1 000 Xg离心3 min收集各组细胞，分别加入蛋白 提取液200 l[1％Triton，150 mmol／L NaCl，25 mmol／L Tris—HCI(pH7．2)，0．5 mmol／L EDTA， 0．5 mmo~L Na VO 及蛋白酶抑制剂鸡尾酒片 (cocktail)(每50 mV片，购自Roche公司)]，震荡 混匀，冰上放置30 min，4 ，10 000 X g离心 10 min，取上清液，用BCA蛋白定量法测定各标本蛋 白含量，加5 X上样缓冲液，95 5 min，置-20 ^NNEXV ^NNE】【V 保存备用。每泳道取上述各标本60 g进行常规 12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5％脱脂牛奶封闭， 10’ 10 然后依次进行一抗和二抗反应[可检测各自剪切体 ^ 10 的抗Caspase·3，一8，PARP抗体以及XIAP，Bcl—xL和 10 B—actin抗体均购自Cell Signaling公司，二抗购自 10 10 10’ BD公司]，ECL显色(ECL试剂盒为Ame~ham ECL— ^NNE】【V plus)。B—Actin作为上样量的内对照。 图2 TRAIL诱导经喷他脒预处理的 2 结 果 l(562细胞凋亡 的Annexin V FITC／PI标记的FACS测定 Fig．2 The Annexin V-FITC／propidium iodine FACS results 2．1 TRAIL诱导经喷他脒预处理的K$62细胞凋 of K562 cells pretreated with or without pentamidine 亡 预先用10 g／ml喷他脒作用细胞20 h后继用 were treated with TRAIL 200 ng／ml TRAIL处理4 h，在光学显微镜下观察细 2．2 T眦 诱导经喷他脒预处理的K562细胞凋 胞形态学改变。由图1可见，单独使用喷他脒或