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细胞生物学实验指导 西北农林科技大学生命科学学院细胞生物学教研室 二00九年十月 实验一 叶绿体的分离与荧光观察 一. 实 验 目 的 1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法. 2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法. 二. 实 验 原 理 将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。 某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。 本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时,将受到许多因素的影响,如温度,光,淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外,在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。  三. 实 验 用 品  1.器材： 1）主要设备: 普通离心机,粗天平,荧光显微镜； 2）小型器材: 剪刀，研钵，移液管，漏斗， 滴管, 10ml刻度离心管,纱布若干, 无荧光载玻片和盖玻片。 2.材料： 新鲜菠菜。  3.试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液, 0.01%吖啶橙(acridine orange). 0.01%吖啶橙的配制：称取0.1g吖啶橙加蒸馏水100ml做干液，贮棕色瓶，置4冰箱保存。 吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长488nm。阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光（即着色特异性），这是由于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物质的位置较少，发绿色荧光，而RNA聚合度低，能和荧光物质结合的位置多，故发红色荧光。四.实 验 方 法 1.叶绿体的分离 （1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称取2g左右，置于预冷的研钵; （2）加10ml的0.35mol?L-1 NaCl溶液研磨匀浆; （3）用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中; （4）取滤液4ml于1000rpm离心2min，弃去沉淀; （5）将上清液3000rpm离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）； （6）沉淀用0.35molL-1NaCl溶液悬浮。 2.叶绿体的观察 （1）取叶绿体悬浮液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。 （2）在普通光镜下观察，注意观察所分离的叶绿体的形态以及其是否完整。 （3）在荧光显微镜下观察叶绿体有无自发荧光，其颜色如何。 （4）取叶绿体悬浮液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察其次生荧光。 五.注 意 事 项： 要得到完整的、有活性的叶绿体，须低温下迅速提取，涂片后立即观察。 六．作 业： 1. 描述你所观察到的实验现象，自发荧光和次生荧光的区别？ 2．叶绿体分离的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 实验二 吖啶橙(acridine orange)染色 观察口腔上皮荧光 一．目的要求 1.熟悉荧光显微镜的原理及使用方法。 2.观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。 二．实验原理 吖啶橙荧光染料可与细胞内DNA和RNA结合。其吸收光谱405nm，发射的荧光光谱是530～640nm，因此，吖啶橙和不同的细胞成分结合后，可发射红橙黄绿蓝各色荧光。 三．实验用品 1．器材：荧光显徽镜、载玻片、盖玻片、染色缸、牙签； 2．材料：口腔黏膜上皮细胞临时制片； 3．试剂: 1)0.1mol/L pH7.0 PBS液。 A液：NaH2PO4·H20 2.76g加蒸馏水至100ml； B液，Na2HPO4·7H20 5.36g加蒸馏水至100ml； 取A液16.5ml、B液33.5ml、NaCl 8.5g用蒸馏水稀释至100ml。 2)0.1％吖啶橙原液：0.1g吖啶橙加蒸馏水至100ml。临用时配制0.