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Free template from 生物化学实验 * * 生命科学学院 主讲：刘连芬聊城生命科学学院E-Mail：liulianfen@ 设计试验 生 物 化 学 实 验 生命科学学院 相关知识背景 生物化学实验 Exit 设计试验 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electropHoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺（acrylamide. Acr）和交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）在催化剂过硫酸铵（ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8简称AP）或核黄素(ribofavn即vitamin B2)和加速剂N, N, N’, N’-四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-tetramethyl ethylene diamine, 简称TEMED)的作用下,聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 生命科学学院 实验原理 生物化学实验 聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应分为连续及不连续系统，在连续系统中凝胶总浓度、缓冲液PH均相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离；在不连续系统中缓冲液离子成分、PH、凝胶总浓度及电位梯度均不连续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分子筛效应，还具有浓缩效应，可使稀的样品在电泳中浓缩成层，因而具有良好的清晰度和分辨率。按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。下面就三种物理效应的原理分别加以说明： Exit 设计试验 生命科学学院 1.样品浓缩效应 上述不连续系统中的三种不连续使样品在浓缩胶中得到浓缩。 （1）凝胶孔径不连续性。在上述三层凝胶中，样品胶及浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，受到的阻力加大，移动速度减慢，因而在2层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带，并在此界面上依其电荷效多少依次排列分开，通常可浓缩样品300倍。 生物化学实验 Exit 设计试验 生命科学学院 （2）缓冲体系离子成分及pH值的不连系性。在三层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）及HCI。Tris的作用是维持溶液的电中性及PH值，是缓冲配对离子。HCI在任何溶液中均易解离出Cl-，在电场中迁移率快，走在最前面成为快离子。电极缓冲液中的甘氨酸（Gly）,其pI=6.0在PH8.9的电极缓冲液中,易解离出甘氨酸根（NH2CH2COO－），而在pH6.8的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度最小，仅有0.1—1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。大多数蛋质pI在5.0左右在pH6.8或pH8.9时均带负电荷向正极移动，其有效迁移率介于快离子和慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；因此氯离子及甘氨酸根沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后再分成多个区带。（如图）。 生物化学实验 Exit 设计试验 生命科学学院 生物化学实验 Exit 设计试验 生命科学学院 （⑶电位梯度的不连续性。电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关（V=mE）,迁移率低的离子在高电位梯度中可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相应的速度（即E高m慢=E低m快）,电泳开始后,由于快离子迁移率最大,就会很快超过蛋白质,因此在快离子后面形成一个离子浓度低的区域,即低电导区,电场强度与电导成反比关系：I=Eη,式中E为电场强度,I为电流强度,η为电导率,E与电导率成反比，所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效迁移恰好介于快、慢离子之间,因此也就聚集在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。由于浓缩胶为大孔胶, 对样品没有分子筛作用。 生物化学实验 Exit 设计试验 生命科学学院 2.分子筛效应: 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。蛋白质进入PH8.9的同一孔径的分离胶后。此时,高电压消失,在均一的电压梯度下,由于甘氨酸解离度增加，加之其分子量小,其有效泳动率增加,赶上并超过各种血清蛋白。进入同一孔径的小孔胶时, 蛋白分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面；反之阻力大,移动慢,走在后面,从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白