斑点印迹法快速优化抗原与抗体的浓度.docVIP

斑点印迹法快速优化抗原和抗体的浓度 ??????? 每一个Western blot都涉及到抗原和抗体的相互作用，因此，抗体浓度并不是一成不变的，优化很重要。一抗和二抗浓度取决于每个抗体的特异性和抗原的特异性，以及样品中存在的抗原量。每个厂家提供的二抗特异性也不同。在改变实验参数，如更换了抗原、一抗、二抗或底物时，有必要重新优化。 一、简便快速的斑点印迹步骤 1、你要准备的材料? 硝酸纤维素膜，剪成1 cm×8 cm的长条 ? 包含抗原的样品，以PBS、TBS或类似缓冲液稀释? 一抗和HRP结合的二抗? 封闭液? 洗涤液 ? 底物工作液：HRP的化学发光底物（如SuperSignal底物）? 胶片或CCD成像系统 二、操作步骤??????? 1. 用TBS或PBS制备蛋白样品的稀释液。稀释度要取决于样品中存在的抗原浓度。由于抗原浓度通常未知，因此有必要检测宽范围的稀释度。SuperSignal底物有着皮克至飞克水平的检测灵敏度。因此样品稀释可以在微克至飞克范围。 ???????? 2. 制备硝酸纤维素膜，用铅笔标上每个待测一抗/二抗的浓度。所需转印膜的数量取决于待筛查的一抗和/或二抗有多少种不同的稀释浓度。通常来说，一抗要检测一到两个稀释度，而二抗要检测两到三个稀释度。例如：使用SuperSignal底物，一抗和二抗可如下稀释：1/1000的一抗和1/50000的二抗 1/1000的一抗和1/100000的二抗1/5000的一抗和1/50000的二抗 1/5000的一抗和1/100000的二抗??????? 3. 将硝酸纤维素膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。每个点的体积越少越好（1-5μl），以保证点尽可能地小。如果需要使用5μl以上的样品，在点完一次后，干燥2-5分钟，再点一次。让膜干燥10-15分钟，或直至无可见水分。 ????????4. 用封闭液封闭膜上的非特异性位点，室温震荡孵育1 h。????????5. 用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释一抗，并加到膜上，室温震荡孵育1h。 ????????6. 用洗涤液洗膜4次，每次5分钟，用尽可能大体积的洗脱液。??????? 7. 用包含1/10体积封闭液的洗涤液稀释二抗，并加到膜上，室温震荡孵育1h。 ??????? 8. 用洗涤液洗膜4次，每次5分钟，用尽可能大体积的洗脱液。??????? 9. 准备底物工作液，将等体积的SuperSignal Substrate Luminol/Enhancer溶液与过氧化物溶液混合。制备足够体积的工作液，以确保印迹点完全湿润，且印迹点在孵育过程中不会干。建议体积：0.125 ml/cm2印迹。 ?????? 10. 将膜放在底物工作液中孵育5分钟。?????? 11. 将膜取出，放在塑料布或其它防护膜上。 ??????? 12. 蛋白一侧朝上，将印迹贴到胶片上，曝光30-60秒。为获得最佳结果，曝光时间可能不同。如果第一次曝光不够，再试试2-5分钟。另外，也可用CCD相机或其它成像仪。??????? 13. 在一张优化好的印迹膜上，底物产生的信号可能会持续6-24小时，这取决于具体的产品。若结果不佳，可重新曝光。随印迹时间的延长，可能需延长曝光时间。如果仍未获得最佳结果，可用不同浓度的抗原和/或抗体重复以上步骤。