《微生物学》2011新编实验指导书.docVIP

生命科学学院 《微生物学》 实验指导书 曾海英编写 适用专业：食品质量与安全专业、农畜产品加工专业等 贵州大学 二OO 七年八月 前 言 微生物学是食品科学的重要组成部分，在食品的贮藏、运输、加工、制造过程中都存在许多微生物学问题，一方面是利用有益微生物的作用制造发酵食品；另一方面是防止有害微生物污染食品，保证食品安全。学习微生物学要求学生理解、掌握与食品有关的微生物类群的形态、结构及功能，微生物的营养、生长与控制，微生物的代谢，掌握微生物学的基本实验技能和检验等，使学生具有扎实的实验技能。课程的任务是使学生掌握丰富的食品微生物学的基本原理、技能、方法以及食品质量的控制等，为学生学习以后的专业课以及毕业后从事食品生产和科研工作奠定坚实的基础。 ⒈规范地掌握的基本操作与基本技能，包括培养基制备、⒉能仔细观察、准确记录、分析判断实验中出现的各种现象；在分析实验结果的基础上，能正确、独立地撰写实验报告；具有解决实际问题的实验思维能力和动手能力。⒊掌握仪器设备（如显微镜、高压锅、振荡培养箱、超净工作台）的工作原理与应用范围，并能正确使用仪器设备。⒋要求课前进行预习，掌握实验目的与原理，熟悉实验内容与步骤，写出预习报告。 实验一 细菌标本片的制备，革兰氏染色法及显微镜的使用 4 实验二 酵母菌的形态观察 6 实验三 霉菌的形态观察 8 实验四 培养基的制备 9 实验五 细菌的分离纯化，培养形态观察及保种 11 实验六 细菌生化实验及外界环境因素对微生物生长的影响 13 附件1 实验报告基本内容要求 18 附件2 实验报告格式 19 实验一 细菌标本片的制备，革兰氏染色法及显微镜的使用 实验学时：2 实验类型：验证性实验 实验要求：必做 一、实验目的 掌握细菌标本片的制作方法及革兰氏染色方法；了解革兰氏染色反应原理；正确掌握显微镜油浸系的使用方法，认真观察细菌的基本形态。 二、实验内容 1、细菌标本片的制备； 2、革兰氏染色； 3、细菌标本片的观察； 三、实验原理、方法和手段 对细菌标本片进行染色的方法很多，但革兰氏染色法是最常用的鉴定细菌的染色法，细菌经染色后革兰氏阳性菌呈紫色、革兰氏阴性菌呈红色。革半氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌，是由这两类细菌的细胞壁的结构和组成不同所决定的。G—菌细胞壁有分层现象，外胞壁含有较多的类脂物质（11-22%），而内胞壁肽聚糖为10-20%，且糖层间无五肽桥，染色后用脂溶性的酒精进行处理（脱脂脱色），会溶解细胞壁中的类脂物质，增强了壁的通透性，致使草酸铵结晶紫与碘形成的复合物会被酒精提取出来。而在G+菌中，由于其细胞壁无分层现象，而其中所含肽聚糖量较高（40-60%,有的甚至达90%），呈网状结构，用酒精处理时（脱水），不但不能增强细胞壁的通透性，反而会使细胞壁脱水，减小了细胞壁的透性，结晶紫与碘形成的复合物就不能被提出来。当用沙黄复染时，阳性菌无法再吸附，故成紫色，而阴性菌在壁透性增加下吸附了新的染色剂，呈红色。 四、实验组织运行要求 根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“以学生自主训练为主的开放模式组织教学。 五、实验条件 1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌培养物 2、染色剂：革兰氏染色液 3、其他仪器或用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、香析油、二甲苯、擦镜纸、生理盐水等 六、实验步骤 1、细菌标本片的制备 细菌细胞微小，呈无色半透明状，只有制成标本片染色以后，才能在光学显微镜下较清楚的显示其形态及特殊结构。作为鉴别的一种重要依据，其制作程序如下： 玻片制备 → 样品抹片 → 自然干燥 → 固定 → 染色 → 干燥 → 镜检 ①抹片固定的目的有如下几点： 除去样品中的水分，使样品材料能很好地贴附在玻片上，以免水洗时被冲掉。 通过固定可能杀死抹片中的微生物，而死的蛋白质比活的蛋白质着色力强，使样品中的细菌色彩鲜明，便于观察。 ②常用的固定方法： 火焰固定法：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，将其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热固定。 化学固定：常用甲醇滴加在标本面上2－3分钟固定。 2、革兰氏染色 染色程序如下： 玻片制备 → 样品抹片→自然干燥→火焰固定→草酸铵结晶紫初染 →1-2→ 水洗→ 革兰氏碘液媒染→ 1-2→水洗→95%乙醇脱色→30″-1→ 水洗→ 沙黄复染→ 1-2′→ 水洗→干燥→显微镜油侵系观察 3、细菌标本片的观察 观察细菌需要放大倍数为1000倍，放大这样倍数的镜头焦距很短，直径很小，但所需的光照强度却最大。因此需滴加与玻璃（1.5）折射率相近的香柏油（1.515）来避免或减少光线通过不同介质发生的折射、反射，从而增加照明亮度，故采用油浸系来观察（HI