实时多重PCR探针的选择和引物的设计 - 广东省疾病预防控制中心.PDF

实时多重PCR探针的选择和引 物的设计 吴德 广东省疾病预防控制中心 病原微生物检验所 2012年9月 你设计过引物和探针吗？ 你设计的引物用来做什么？ 几个问题 • PCR的目的：检测,克隆,基因分型. • PCR的类型：定量PCR,RT-PCR,长片段 PCR. • 样品材料：基因组DNA,RNA,微小RNA. • 可能的问题：假基因，SNP,变异 。 一、引物的设计 • 引物的特异性 – 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8 个互补碱基完全同源 • 如何验证引物的特异性 埃博拉： 5`-GAGACAACGGAAGCTAATGC-3` 一、引物的设计 • 避开产物的二级结构区 – 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二 级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级 结构区域 一、引物的设计 • 长度 – 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27bp – 退火温度将超过延伸温度 • G+C含量 – G+C含量一般为40%~60% – 公式Tm=4 （G+C）+2 （A+T ）估计引物的Tm 值 – 两条引物的退火温度相差不超过5℃ – 要避免聚-dC，dG， dA，dT区域 一、引物的设计 • 碱基础随机分布 – 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有 聚嘌呤或聚嘧啶的存在。 – 尤其3 ′端不应超过3个连续的G或C。 一、引物的设计 • 引物自身 – 引物自身不应存在互补序列 • 引物自身会折叠成发夹状结构，会因空间位阻而影 响引物与模板的复性结合。 • 自身引物为模板，形成引物二聚体 一、引物的设计 • 引物之间 – 两引物之间不应互 补，尤应避免3 ′ 端的互补重叠以防 引物二聚体的形 成。 – 一对引物间不应多 于4个连续碱基的 同源性或互补性。 一、引物的设计 • 引物的3 ′端 – 引物的延伸是从 3 ′端开始的，不 能进行任何修饰 – 3 ′端也不能有形 成任何二级结构 可能，除在特殊 的PCR （AS- PCR）反应中 – 引物3 ′端不能发 生错配。 引物设计举例 • 步骤 – 获得目标序列 （/ ） – 对获得的序列进行多序列比对(MEGA) – 挑选目的片段 – 利用引物设计软件进行分析 /bioapps/primer 3_www.cgi#PRIMER_SEQUENCE_INPUT – 引物的特异性评价 /Blast.cgi 二、简并引物的设计 • 简并引物的概念 – 简并引物是指 代表编码单个 氨基酸所有不 同碱基可能性 的不同序列的 混合物。 二、简并引物的设计 • 简并度 – 5-NAGSGNGCDTTANCABK-3