小菜蛾羧酸酯酶基因的克隆及其序列分析3.PDF

中　国　生 　物 　工 　程 　杂 　志 第 23 卷第 4 期 CHINA BIOTECHNOLOGY 2003 年 4 月 小菜蛾羧酸酯酶基因的克隆及其序列分析 王少丽 　盛承发 　乔传令 ( 中国科学院动物研究所 农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室 　北京 　100080) ( ) 摘要 　利用 CODEHOP 设计简并引物 ,通过反转录多聚酶链式反应 RTPCR 克隆小菜蛾 Plutella xy lostella 抗性种群中抗性相关的羧酸酯酶基因 ,随机挑取测序 5 个阳性克隆进行测序 ,测序结果 经过 blastx 比较 ,发现所获得的大约 420bp 的基因片断均为羧酸酯酶基因 ,与双翅 目昆虫蚊子的 氨基酸序列同源性达 85 %以上 。 关键词 　小菜蛾 　简并引物 　RTPCR 　羧酸酯酶基因 　　小菜蛾 Plutella xy lostella (L . ) 属鳞翅 目菜蛾 回收试剂盒购 自上海生物工程公司 ,p GEMT 载体 科 ,是十字花科蔬菜的主要害虫之一 ,每年全世界 为 Promega 公司产品。 由此而造成的经济损失达 10 亿美元[ 1] 。小菜蛾对 1. 3 　简并引物的设计 多种杀虫剂均易产生抗性 , 已成为世界上最难防治 根据已经发表的双翅 目昆虫的羧酸酯酶基因 的害虫之一 。所以对小菜蛾的抗性机理研究就显 的保守区段 ,利用 CODEHOP[8 ] 来分别设计简并性 得尤为重要 ,而现在主要研究集中在其生物测定和 上游和下游引物 : 生化机理方面[2 ,3 ] , 对其分子机理的研究刚刚开 上游引物 : 始[4 ,5 ] 。已有研究表明 ,小菜蛾对有机磷杀虫剂的 5′CA GGA GTACTCCTTCCA GGGnathccntayg3′; 抗药性与羧酸酯酶活性的增加有关[6 ] , 目前与抗性 下游引物 : 相关羧酸酯酶基因的克隆仅限于蚊虫与果蝇等少 5′ccnccnytrggnyt GTTGTTGTA GTGGTA CAA G3′。 数模式昆虫 ,鳞翅 目昆虫中羧酸酯酶基因被成功克 1. 4 　总 RNA 的提取和 RTPCR ( 隆尚无先例 。 总 RNA 利用 TRIzol 一步法提取 参照试剂盒 ) ( ) 利 用 反 转 录 多 聚 酶 链 式 反 应 ( reverse 说明书 , 以oligo dT 为引物进行反转录 ,然后以上 transcription polymerase chain reaction , RTPCR) 的方 述的一对简并性引物进行 PCR 扩增 ,扩增程序为 : 法对小菜蛾的羧酸酯酶基因 cDNA 片断进行了克 预变性 95 ℃预变性 5min ,然后进行 35 个循环 ,循 隆和序列分析 ,为获取小菜蛾羧酸酯酶基因全序列 环的条件为 94 ℃变性 1min ,58 ℃退火 1min ,72 ℃延 以及深入研究小菜蛾抗性分子机理奠定基础 。 伸 1min ,最后在 72 ℃条件下延伸 10min 。