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光学显微镜的使用简单染色及革兰氏染色 摘要 显微镜的使用在我们学习微生物等课程中非常重要，历史上显微镜的发明和显微镜的每一次创新都给人类的认知带来了飞跃式的发展；给人类的生活带来了空前的拓展。在提倡科技创新的今天，显微镜的使用已经成为我们的一项基本技能。本次试验的主要目的是通过用油镜观察经过复染色的细菌玻片，分辨细菌的革兰氏阴阳性。 通过实验学习光学显微镜油镜的使用原理与方法、细菌的革兰氏染色法及分类鉴定的原理。 为了研究细菌的形态，微生物学家发明了对细菌的染色，用两种以上的称复染，革兰氏发明了复染色法；先后用两种染色剂和媒染剂、脱色剂组合，由此而命名为革兰氏染色。革兰氏染色不仅可以观察细菌的形态，同时将细菌分为两大类。一类是染色阳性菌是紫色，另一类染色阴性的是红色。由于细菌的结构上的差异，形成了不同的染色效果。了解染色性能有助于临床用药和细菌的鉴定。 关键词 显微镜的使用（Use of Microscope）革兰氏染色（Gram stain）复染（counterstain） 媒染（mordant dyeing）脱色（discoloration） 一、实验目的 了解显微镜的构造及使用 学习显微镜（特别是白色圈标记的油镜）的使用方法 学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术 初步了解不同细菌的形态特征 了解革兰氏染色原理，并掌握其方法 实验原理 （一）、普通显微镜的基本原理 1、基本原理 显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。 2、油镜 微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。利用油镜的目的是增加显微镜的分辨力。 （二）、简单染色的原理 利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的物质为一类苯环上连着发色基团或助色基团的有机化合物。发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使其形成盐。只有发色基团而无助色基团的苯化合物（色原）即使有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，难以与细胞结合而染色。常用的微生物染料都是盐，分碱性染料（美蓝-亚甲蓝，结晶紫，碱性复红，沙黄-番红，孔雀绿)和酸性染料（酸性复红，伊红，刚果红）。通常采用碱性染料进行简单染色，因为微生物细胞在碱性，中性及弱酸性的环境中多带有负电荷，而染料电离后染色部分带正电性，易相互结合。当细胞处于酸性条件时（如分解糖类产酸）所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二： 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上； 二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 （三）、革兰氏染色的基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医师 Gram 创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色 的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。 细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的， 在染色过程中，当用乙醇处理时， 由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而 不易脱色。因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高。当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色。然后又被染上了复染液(番红)的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料(basic dye)初染液；媒染剂(mordant)；脱色剂(decolorizing agent)和复染液 (counterstain)。 碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定