细胞培养技术及常见问题-中国生物医药网.PPT

细胞培养技术及常见问题 复旦大学附属中山医院 中国生物医药技术服务中心 ※实验室细胞培养技术 一、细胞培养的设备条件 无菌室 密闭性好，方便消毒；干燥透气，但工作时和外界无空气对流。 超净工作台 CO2培养箱 定期清洁消毒，保持湿度。 培养器皿的清洗与消毒 浸酸6小时以上→流水冲洗15次→双蒸水浸洗3次→烘干、包装→消毒。 二、培养基基本要求 1、营养成分 氨基酸 12种必须氨基酸，或需要添加谷氨酰胺。 单糖 葡萄糖吸收最高，半乳糖最低。神经元培养需另外添加。 维生素 无机盐及微量元素 2、促生长因子和激素 3、渗透压 260~320mOsm/kg范围内都适宜。 4、PH 7.2~7.4 5、必须使用三蒸去离子水 6、血清 牛血清适用于大多数哺乳类动物细胞 可分为 ：小牛血清、新生牛血清、胎牛血清 质量标准 可向厂家索取质检报告 ＊总蛋白含量：不低于35~45g/L ＊球蛋白含量：﹤20g/L，越低越好 ＊血红蛋白含量：越低越好 外观：土黄或棕黄色，清凉透明，无或少许沉淀，粘稠。 ＊大量沉淀物：污染或蛋白变性 ＊颜色为棕红色：血红蛋白含量高，有溶血 ＊液体稀薄：掺入的生理盐水过多 储存和使用 ＊热灭活 高质量的胎牛血清不必热灭活，但 培养ES细胞、平滑肌细胞时建议热灭活。 ＊分装为小包装，储存于-20°C，避免反复冻融。 ＊使用浓度，一般为5%~20%，常用10%。。 缺点 ＊过多添加血清，可能使细胞发生变化。 ＊血清中某些物质可能对细胞有毒性作用。 ＊不同批号血清之间质量有差异。 7、促贴壁物质 鼠尾胶、明胶、FN等。制作时严格无菌操作。 三、培养基的选择和使用 MEM 成分简单，贴壁细胞首选。 DMEM 分高糖型和低糖型。 IDMEM 适合细胞密度低，生长困难的细胞。如杂交细胞的筛选，DNA转染后转化细胞的筛选培养。 RPM1640 应用最广泛的培养基之一。悬浮细胞培养首选，主要针对淋巴细胞，也适合其他细胞。 199、109培养基 成分齐全，培养效果较好。 F10培养基 适合小鼠及人类二倍体细胞培养。 F12培养基 适合单细胞分离培养及无血清培养。 McCoy’s5A培养基 特别适合原代细胞及较难培养细胞的生长。 四、其他培养用液 1、平衡盐溶液 D-Hank’s液不含Ca2+、Mg2+离子，适合于配制胰酶溶液。 Hank’s液在5%CO2环境中会迅速变酸，不能放入CO2温箱。 2、消化液 胰酶 常用0.1%~0.25%，PH8~9 EDTA溶液 抑制二价离子，破坏细胞间连接，适用于贴壁较牢的细胞。可与胰酶混合后使用， 使用浓度为0.02%，配制时加碱助溶。 胶原酶溶液 作用对象是胶原组织，不损伤细胞，常用于原代培养。使用浓度为0.1~0.3mg/L， 或20万U/L，PH 6.5。 3、pH调整液 5.6%NaHCO3溶液 HEPES液 增强培养基的PH缓冲能力 3、抗生素 青-链酶素双抗 预防G+、G-菌，青霉素使用浓度为10万U/L，链霉素为0.1g/L。 可加入卡那霉素预防支原体污染。 加入两性霉素抑制霉菌。 稳定性差，只有3~5天。 需做剂量反应实验，确定抗生素对培养细胞产生毒性的剂量水平。 4、谷氨酰胺补充液 易降解，临用前添加。使用浓度为0.002mol/L。 五、污染的预防和排除 1、预防 严格遵守无菌操作规程，不抱任何侥幸心理。 配制的液体、分装的血清，每批都必须随机抽取样本做无菌试验，确认无菌才可投入使用。 及时冻存状态良好的细胞，以备不时之需。 培养试剂和操作器械要专人专细胞专用。 每次传代时留一瓶作备用，当传代细胞生长正常时再丢弃。 2、污染的排除 及时高压灭菌污染的细胞，然后丢弃。（首选） 对于污染较轻，且来源困难的高价值细胞 （1）用无抗培养基传代细胞，接种于多孔板中 （2）将浓度梯度稀释后的抗生素加入孔内，例如，两性霉素B推荐下列浓度：0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/ml。 （3）每天观察细胞毒性指标，如脱落、空泡、变圆等。 （4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素培养液培养细胞2~3代。 （5）在无抗培养基中传代一次。 （6）重复步骤4 （7）在无抗培养基中培养4~6代，确定污染已被消除。 六、细胞的冻存和复苏 1、冻存 冻存液 7份培养液、2份FBS、1份DMSO或甘油。 细胞密度 （1~10）×106个/ml 步骤 4