离体小鼠心肌细胞通讯协议.docVIP

分离小鼠心肌细胞Protocol 实验动物：小鼠, 体重20~30g 1急性分离心肌细胞 A 实验准备 ： 1）无钙台氏液：配500mL无钙台氏液(50mL台氏母液+450mL去离子水+1g 葡萄糖), 用NAOH 调PH， 一般在7.35~7.4之间即可，注：充氧后调PH值，否则充氧后PH下调。调PH值前严格校正PH计，小鼠心肌细胞对PH值特别敏感。 表1：台式母液配方 mM MW g/L g/500ml (10x) NaCl 126 58.44 7.363 36.82 KCl 5.4 74.55 0.403 2.02 Hepes 10 238.3 2.383 11.92 MgCl2.6H2O 1.0 203.3 0.203 1.02 NaH2PO4.2H20 0.33 156.01 0.052 0.2574 CaCl2 1.8 147.03 Glucose 10 198.2 注：CaCl2, Glucose配制时后加，（浓度0.9M CaCl2母液6.616g(有水)或者 4.995g(无水)+50ml去离子水），0.2ml CaCl2母液/100ml无钙台氏液 2）称取5mg胶原酶Ⅱ+8mg白蛋白 3）配有钙液200ml： 即200ml无钙液+0.4ml CaCl2 (0.9M)。注：小鼠心肌细胞对钙浓度特别敏感，我们为了缩短心脏复跳时间，减少心肌耗氧，把有钙液中钙离子浓度降到正常的 浓度的1/4 4) 准备器械：大弯剪刀一把，小直剪刀两把，直镊子两把，止血钳两把，弯镊子两把，纱 布一块，注射器60mL一个，10mL一个；手术线一团(小鼠主动脉比较细，手术线比大鼠的要细)；表面皿三个，小烧杯50mL 三个，量筒50mL两个， 500mL一个；大烧杯500mL一个250mL一个；滤纸若干！滴管 4个, 7号注射针头一个（尖端磨平，靠近尖端两厘米处用止血钳夹出一道深沟以便于固定主动脉时系线）。 5）KB 液配方 mM MW g/L Glutamic acid (谷氨酸) 70 147.13 10.3 Taurine(牛黄酸) 15 125.14 1.875 KCl 30 74.55 2.237 Hepes 10 238.3 2.383 MgCl2.6H2O 0.5 203.3 0.1015 Glucuse 10 198.2 1.982 EGTA 0.5 380.4 0.19 KH2PO4 10 136.09 1.36 注：5M KOH 调PH 值（7.3-7.4），5M KOH 配制：28g KOH 溶于100ML去离子水，KB 液保存在-20℃冰箱中保存。 B 实验过程 1）、实验前准备： （1）、准备仪器：电热恒温器（带水泵的）、Langendorff灌流系统。 （2）、检查氧气瓶里是否有氧气。 （3）、打开恒温灌流装置的电源开关，调节电热恒温器的水温，泵出的水打入冷凝管，使通过冷凝管的灌流液保持37℃ （4）、清洁Langendorff管路，第一次使用先泡酸后用蒸馏水冲洗干净，以后每次使用前先用去离子水将Langendorff管冲洗3遍即可开始实验。 （5）、配制好无钙的细胞外液及有钙液，并取约50ml有钙液置于表面皿中后放置在冰袋上，使其温度降到0℃左右；另一50ml有钙液置于表面皿中放入4℃ （6）、向冲洗后的Langendorff管中加入有钙液，用注射器轻轻吸出气泡，并向管中通入氧气。有钙液浓度降到正常浓度的1/4，灌入大概50ml有钙液，上面倒无钙液。 （7）、分别称取5mg胶原酶和8mg白蛋白，用约50ml无钙液溶解、备用。 （8）、10ml注射器连接预备好的7号针头，手术线打松结待用。 2）、正式试验： （1）、选取小鼠，称重，用1%戊巴比妥麻醉(腹腔注射），麻醉剂剂量尽量小，如果无需监测心电可采用断髓法处死小鼠。不