实验八动物组织DNA的提取.ppt

动物组织中总DNA的提取 实验目的 了解真核生物基因组DNA提取的一般原理 通过动物组织DNA的提取，掌握DNA 提取的方法和步骤 高等动物、植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，获得纯度高、基因组相对完整的基因组是以后PCR分析，基因文库的构建，基因探测等的研究的基础。 动物细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ。 DNA提取原则 保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 实验原理 细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA）称为总DNA。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。 目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为CTAB法和SDS法（表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来）。 SDS法提取动物组织DNA SDS（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即DNA溶液。 试剂 提取缓冲液：200 mmol/L Tris·Cl (pH8.0), 25mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 0.5% SDS 24：1的氯仿：异戊醇 预冷无水乙醇 操作步骤 肝脏1g左右, (剪碎) 置研钵中，加入2-3mL提取缓冲液， 研磨成浆；吸入10mL EP管中，摇动混匀； 60℃水浴保温15min，不时颠倒混匀； 室温下3000rpm离心7min； 小心吸上清于另一只离心管中，加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀； 室温下3000rpm离心10min； 小心将上层水相吸入另一只离心管中； 重复4-5步2-3次; (此步不做） 加入等体积预冷无水乙醇，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 结果分析与讨论 * * Total DNA extraction from eukaryotic tissue SDS抽提液配方(1000ml): *