关于质粒的知识－PGL3，pRL 和pGL4.PPT

萤光素酶报告基因产品培训 2008.6 各种报告基因的优点和缺点 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例 检测板 报告基因应用举例1－辨别启动子/增强子 “碰撞启动子”: 1) 全序列: 2) 逐步缺失: 报告基因应用举例2－药物对启动子活性的影响 Promega eNotes April，2000 Focus: Gene Reporter Assay Alpha-Melanocyte-Stimulating Hormone Induction of Luciferase Expression under the Control of Human Tyrosinase Promoter/Enhancer α-促黑激素诱导人酪氨酸启动子/增强子控制下的萤光素酶表达 by Zakhartchenko.V et al. 实验中的质粒 实验载体 α-MSH inducible plasmid pGL3-Tyr14A 阳性对照 pGL3-Control 阴性对照 pGL3-Basic 内对照 pRL-SV40 细胞培养和瞬时转染 应用举例2 小鼠黑素瘤细胞B16-F1保存在含10％胎牛血清的DMEM培养基中。37oC，潮湿，5％CO2环境中培养。每两月从冻存管中复苏一次。 转染前一天， 6孔板接种，密度为2x105/孔， 转染pGL3-Control, pGL3-Tyr14A （2ug/孔） pGL3-Basic 载体， pRL-SV40 (0.2ug/孔）， DNA:SuperFect?=1:5(ug:ul), 细胞与DNA-SuperFect?复合物共孵育2小时 药物处理 应用举例2 配制药物储存液: 0.1mM的NDP-alpha-MSH,-20oC pGL3-Tyr14a和pRL-SV40共转染B16-F1细胞 细胞分成两组： 1.用DMF处理（对照） 2.用10－7M的NDP-alpha-MSH处理 含有NDP-alpha-MSH或DMF或没有添加物的培养基每两天更新一次。 在选定时间内（图1）裂解细胞，用DLR?试剂分析，一式三份 B16-F1细胞中萤光素酶的诱导表达 应用举例2 双萤光素酶数据分析 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举 萤火虫生物萤光的化学 海肾萤光素酶反应 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例 FAQ 关于质粒的知识－PGL3，pRL 和 pGL4 pGL3 是萤火虫萤光素酶报告基因 pGL3 有4个载体 pGL3-Basic pGL3-Control pGL3-Enhancer pGL3-Promoter pRL是海肾萤光素酶载体 pRL有4个载体 pRL-null pRL-TK pRL-CMV pRL-SV40 pGL4载体 (现有37个） 相关元件 萤火虫 luc2,luc2P,luc2CP 萤光素酶 海肾 hRluc,hRlucP,hRlucCP 启动子 SV40,TK,CMV. mini Hygro 选择标记 Neo Puro 调控序列 CRE,NFAT-RE, NF-κ-B pGL4虫萤光素酶报告载体 pGL4海肾萤光素酶报告载体 培训内容 报告基因应用举例 化学原理 载体的选择 检测试剂的种类 细胞系的应用 数据分析举例 检测试剂 虫萤光素酶检测试剂 非均质 Luciferase Assay System,E1500.E4030 均质 Bright-Glo?, Steady-Glo?, ONE-Glo? 海肾萤光素酶检测试剂 Renilla Luciferase Assay Enduren Viviren 双萤光素酶检测试剂 非均质 Dual-Luciferase? Reporter Assay System 均质 Dual-Glo? 均质检测与非均质检测 萤光素酶(萤火虫)检测系统(低通量) E1500, E4030 试剂盒组成: 萤光素酶底物(冻干粉) 1瓶+检测缓冲液 两种裂解液之一: CCLR, RLB 非均质性检测 萤光水平高 需要细胞提取物 用一个萤光素酶做报告基因的实验步骤实验举例(检测启动子功能） 一、克隆及转染 1.克隆：将待测启动子序列克隆进pGL3-Basic或pGL3-Enhancer或pGL4载体中。 2. 用pGL3-Control, pGL3-Basic 和实验载体分别转