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　　hURAT1基因真核表达重组体的构建及意义 【摘要】 目的 构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体。方法 提取人全血基因组DNA，进行PCR扩增，将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，应用核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1 958 bp的基因片段。该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞。重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定，证实hURAT1片段插入序列和方向正确。结论 hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确，可用于后续基因功能研究，尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究。 【关键词】 人尿酸盐转运子1；pcDNA3.1(-)；基因；克隆，分子；内含子；高尿酸血症 ［ABSTRACT］ Objective To construct the rebinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/hURAT1. MethodsTotal genome DNA normal human total blood. DNA plification. PCR product ed into DH5α Ecoli. Constructed pcDNA3.1(-)/hURAT1 e digestion analysis and DNA sequencing. Results A 1 958 bp fragment, including exon 2 to intron 5 of hURAT1 genome DNA, plification. BamHⅠ and EcoRⅠrestriction enzyme digestion and DNA sequencing confirmed ent of hURAT1 utation function research in the CDS or intron. ［KEY T Easy Vector(PROMEGA公司)、T4 DNA 连接酶（PROMEGA公司）、胰蛋白胨（SANGON公司）、酵母提取物（SANGON公司）、琼脂（SANGON公司）、氨苄青霉素（SANGON公司）、限制性内切酶（FERMENTAS公司）、pcDNA3.1(-) Vector(INVITROGEN公司)、DH5α感受态细胞（TIANGEN公司）、质粒小规模抽提试剂盒（AXYGEN公司）、质粒中规模抽提试剂盒（QIAGEN公司）。PTC225型高通量PCR仪（MJR公司）、UVP凝胶成像仪（BIORAD公司）、MIR 262 恒温孵箱（SANYO公司）、低温离心机（EPPENDORF公司）、BioRAD 电泳仪（BIORAD公司）、DU650型紫外线分光光度计（EPPENDORF公司）、超净工作台(Class Biological Safety Cabi Ⅱ，BAKER公司)。 1.2 PCR扩增 按照基因组DNA提取试剂盒说明提取正常人全血DNA。以Gene Bank公布的hURAT1基因组DNA序列为模板，并根据所要构建的表达载体要求在5′和3′端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增包含第2外显子至第5内含子在内的一段序列。所有引物由上海生工生物技术有限责任公司合成(见表1)。应用多重PCR方法，首先扩增片段①，使用1FBAMH和1R作为引物，扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 40 s，66 ℃退火 40 s，68 ℃延伸1 min30 s，35个循环；68 ℃终延伸 10 min。其次扩增片段②，使用2F和2RECOR引物，扩增条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 40 s，68 ℃退火 40 s，68 ℃延伸 50 s，35 个循环；68 ℃终延伸 10 min。最终以片段①和片段②PCR产物1∶1混合为模板，扩增目的片段，使用1FBAMH和2RECOR引物，扩增条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 40 s，64 ℃退火 1 min 10 s，68 ℃延伸 2 min，35个循环；68 ℃终延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳，紫外线凝胶检测仪检测结果。PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收，定量，分装，一20 ℃贮存。表1 PCR扩增hURAT1基因组DNA片段引物引物名称引物序列 1.3 重组体的构建 1.3.1 pGEMT Easy Vector/ hURAT1重组体的构建 ①连接：将末端加入dATP的扩增片段与pGEMT Easy Vector按照摩尔比 3～8∶