丽蝇抗病毒肽Alloferon1基因串联体的构建.docVIP

　　丽蝇抗病毒肽Alloferon1基因串联体的构建 【摘要】 目的： 克隆和表达Alloferon1基因2串联体. 方法： 利用同尾酶法基因同向串联方案，在人工合成Alloferon1全基因的基础上，将Alloferon1基因由单体连接成2串联体，继而将获得的正确Alloferon1基因2串联体插入pGEX4T1表达载体诱导表达. 结果： 构建的Alloferon1基因2串联体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因串联体的序列与设计的序列完全相同. Alloferon1基因2串联体插入pGEX4T1载体后，重组菌经37℃诱导4 h，SDSPAGE分析结果显示，该串联体得到较高水平的表达. 结论： Alloferon1基因2串联体的构建与表达均获得了成功. 【关键词】 抗病毒肽；基因,Alloferon1；同尾酶；同向串联；大肠杆菌 　【Abstract】 AIM： To clone and express a tandem of repeated gene rebinant plasmid pGEX4T1(Alloferon1)2.METHODS： ethod. Then the correct tandem of gene repeats e digestion analysis sho of Alloferon1 gene olecule mass of 32×103 of 2 repeats of Alloferon1 gene is constructed and expressed in E.coli successfully. 　　【Keyer； tandem； Escherichia coli 　　0 引言 　　Alloferon1是俄国科学家Chernysh等［1］于2002年从人工干预热灭活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌丽蝇幼虫血淋巴中分离得到的一种抗病毒和抗肿瘤的小肽，是由13个氨基酸残基组成的阳离子肽，其一级结构与昆虫防御素，天蚕素，富含脯氨酸的抗菌肽相似.研究表明Alloferon1对甲型乙型流感病毒、肝炎病毒和慢性髓性白血病K562细胞均有抑制作用，是一个具有潜在应用价值的小活性肽. 由于其分子质量较小，克隆、表达、纯化、检测都会有一定难度，本实验拟采用同尾酶法基因同向串联的方法［2］，将Alloferon1基因串联起来，构建该基因的2串联体后表达该串联体，以增加其稳定性和表达量，为进一步的纯化和生物活性测定奠定基础. 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α，质粒pGEX4T1均为本室保存；质粒pUC18，T4 PNK，限制酶，Xgal，DNA maker，IPTG均购自TaKaRa公司，UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒，小量质粒提取试剂盒均购自天根公司，其它试剂均为国产分析纯，基因由上海生工合成. 　　1.2 方法 　　1.2.1 Alloferon1基因的设计与合成 根据瑞士微生物肽数据库（APD）收录的Alloferon1氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱密码子设计合成该基因序列，利用XbaI和NheI互为同尾酶的特点，在基因的两端加入了EcoRI，SalI限制性内切酶切割后的粘性末端和XbaI，NheI限制性内切酶位点，以便于构建串联体和表达．在XbaI位点后和NheI位点前加入蛋氨酸密码子，以便于表达串联体之后将其裂解为单体. 　　1.2.2 Alloferon1基因的复性、磷酸化和纯化 将合成的Alloferon1全基因片段溶解于适量灭菌双蒸水中，95℃水浴5 min后，关闭水浴锅自然冷却至30℃以下. 退火的Alloferon1基因片段用T4 PNK进行磷酸化，37℃水浴30 min，70℃水浴灭活10 min. 磷酸化后的Alloferon1基因片段用乙醇沉淀的标准方法回收. 　　1.2.3 Alloferon1基因2串联体的构建 将Alloferon1基因与用EcoRI和SalI限制性消化的pUC18 DNA连接后转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选出克隆重组子. 将上述克隆重组子以NheI酶切初步鉴定后进行DNA测序，将获得正确序列的克隆重组质粒命名为pUC18Alloferon1. 取上述重组质粒两份，一份用ScaI和XbaI双酶切后回收大片段，另一份用ScaI和NheI双酶切后回收小片段，将上述回收的大小片段连接后转化大肠杆菌DH5α. 通过蓝白斑筛选出2串联体克隆重组子. 将上述重组子用EcoRI和SalI酶切初步鉴定后进行DNA测序，将获得正确序列的2串联体克隆重组质粒命名为pUC18(Alloferon1)2. 以上过程均参照文献［3］ 进行. 　　1.2.4 Alloferon1基因 2串联体的表达 将获得的2串联体重组质粒p