原发性肝癌组织双向电泳技术优化.docVIP

　　原发性肝癌组织双向电泳技术优化 【摘要】 【目的】 优化双向凝胶电泳的实验步骤，总结出一套适用于原发性肝癌组织的双向凝胶电泳技术。【方法】 对双向电泳实验中的关键环节：样本处理、上样方法、聚焦条件等进行研究与优化，考马斯亮蓝染色后进行凝胶图像比较。 【结果】 采用7 mmol /L尿素、2 mol /L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol /L DTT、5 g/L (pH 3-10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF作为裂解液，丙酮沉淀蛋白，主动水化上样法，聚焦电压达到140 kV可以得到分辨率高、重复性好的结果。 【结论】 上述改良提高了2-D图谱中蛋白位点的分辨率和重复性，为原发性肝癌组织的蛋白质组学研究奠定了基础。 【关键词】 原发性肝癌; 蛋白质组学; 双向电泳 　Abstract： 【Objective】 To establish a set of tensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE) techniques for proteomic research of hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. 【Methods】 Different methods or condition for key procedures of 2-DE ized， including sample preparation， sample loading methods， iso-electronic focusing (IEF)， paring assie blue staining. 【Results】 High-resolution results mol/L urea， 2 mmol/L thisurea， 4%CHAPS， 100 mmol/L DTT， 0.5% (pH 3-10) IPG buffer， 1 mmol/L PMSF as lysis buffer， actone precipitate protein， initiative rehydration method and IEF to 140 kV. 【Conclusion】 The optimized method provided 2-D results ic research for HCC tissues. 　　原发性肝癌(以下简称肝癌)是我国最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在我国恶性肿瘤中位居第二[1]。蛋白质组学是研究肿瘤发生机制[2]，寻找肿瘤标志物的重要工具，对于肝癌发生机制和治疗作用靶点的研究具有重要意义[3]。我国早在2003年就启动了人类肝脏蛋白质组计划(HUPO)，并取得了一定的研究成果。但关于肝癌组织双向电泳的技术却少完整系统的报道，为了建立高分辨率可重复的肝癌组织双向凝胶电泳技术，我们对人肝癌组织的双向电泳技术中的关键环节进行了研究对比，优选出一套适合肝癌组织的双向凝胶电泳方法，供从事肝脏蛋白质组学双向电泳的技术人员参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材 料 　　1.1.1 标本采集 　　原发性肝癌组织来自我院肝癌切除术患者。组织离体后立即以预冷PBS冲洗，在冰上分装置入冻存管，液氮中速冻，后转入-80 ℃冰箱中保存备用。所有病例均经术后病理证实为原发性肝细胞癌。 　　1.1.2 试 剂 　　丙烯酰胺、甲叉双丙稀酰胺、过硫酸胺、四甲基乙二胺(TEMED)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、尿素、十二烷基硫酸钠(SDS)、3-[3-(胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、甘氨酸、IPG缓冲液(pH 3 ～ 10)、蛋白酶抑制剂、碘乙酰氨(IAA)、硫脲、18 cm 胶条(pH 3 ～ 10 NL)均为Amersham公司产品。TCA、丙酮为Sigma公司产品。无水乙醇为国产分析纯(广州化学试剂厂)，所有溶液均用去离子水配制。 　　1.1.2 主要设备 　　Immobiline Dry Strip，Ettan IPG 3等电聚焦电泳仪，Ettan DALT six 600 垂直电泳槽，Imagescanner高密度扫描仪，ImageMaster软件均购自Amersham公司。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 蛋白质样品制备 　　粗样本制备：取肝癌组织100 mg，液氮冷冻研磨，加入0.5 mL裂解液(含10 g/L PMSF蛋白酶抑制剂)，裂解液(7 mmol/L尿素、2 mol/L硫脲、40 g/L CHAPS、100 mmol/L DTT、50 g/L(pH 3 ～ 10) IPG buffer，1 mmol /L PMSF)，超声裂解，15 ℃，离心10 mi