APX同工酶电泳.DOC

过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、目的 1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程 3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程 二、实验原理： 1、电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。泳动速度V= E·q·a (1) 6πrη u= q·a (2) 6πrη 由（）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。迁移率粒子的大小（r）非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。聚丙烯酰胺结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺适合作区带电泳的支持介质。要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.0～0.之间。在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝ΣmiZi2 (3) （)式中，mi为离子的浓度，Zi为离子的价数。 酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N,N-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。冷却可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T％表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见表1）。 表1 凝 胶 浓 度 选 用 表 物??? 质 分 子 量 范 围 适用的凝胶浓度(%) 蛋 白 质 ?????? ?＜104 ??????? 20～30 ??????? 1×104～4×104 ??????? 15～20 ??????? 4×104～1×105 ??????? 10～15 ??????? 1×105～5×105 ???????? 5～10 ??????? ＞5×105 ???????? 2～5 核??? 酸 ??????? ＜104 ??????? 15～20 ??????? 104～105 ???????? 5～10 ??????? 105～2×106 ???????? 2～2.6 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 系统的不连续性表现在以下几个方面： 凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 （3）