柴胡皂甙d对狼疮肾炎的治疗作用.docVIP

　　柴胡皂甙d对狼疮肾炎的治疗作用 【摘要】 目的：观察柴胡皂甙d (SSd)对NZB在肾小球的沉积也减少. 结论：SSd对NZB(μ链特异性)异硫氰酸荧光素(FITC)直接免疫荧光抗体均购自美国Sigma公司. 1.2方法 1.2.1实验动物分组将实验动物随机分为3组：SSd治疗Ⅰ组［n=8，SSd腹腔注射，剂量2 mg/(kg·d)，浓度0.2 g/L］； SSd治疗Ⅱ组［n=6，4 mg/(kg·d)，浓度0.4 g/L］；空白对照组［Ⅲ组，n=6， 腹腔注射无菌生理盐水10 mL/(kg·d)］. 于实验第6周末处死3组全部小鼠，取血及肾组织标本. 1.2.2各组小鼠血尿指标的检测实验的第2，4，6周末，收集各组小鼠尿液，用考马斯亮蓝法检测尿蛋白含量(mg/L)；自动生化分析仪测定血清肌酐(SCr) (μmol/L)；酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清皮质酮(CS) (nmol/L)；ELISA测定血清抗dsDNA抗体(AdsDNA) (A450 nm). 1.2.3各组小鼠肾组织学检查HE, PAS染色，光镜观察肾组织病变情况，对肾小球和肾小管损伤程度进行评分 ［3］： 每例肾组织观察20个肾小球横断面，对每个肾小球进行半定量评分. 计算受损肾小管比例(200个随机选择的肾小管中扩张、萎缩、坏死的肾小管所占的百分比). 电镜观察系膜区、内皮下、基底膜内、上皮下是否有电子致密物沉积；上皮细胞足突是否融合［4］. 免疫荧光（immunofluorescence, IF）观察肾组织IgA, IgG, IgM的沉积，根据荧光强度来判断免疫复合物的多少，选取10个肾小球用半定量法进行评分［4］. 1.2.4肾脏组织IL6和IL10 mRNA表达的检测从Nucleotide中查找小鼠IL6, IL10 和βactin基因序列，应用PrimerPremier 5.0引物设计软件，进行引物设计. ①IL6引物序列：上游5′ GTGGCTAAGGACCAAGACCA 3′，下游5′ TTCCAAGAAACCATCTGGCTA 3′；② IL10引物序列：上游5′ TCCTTGGAAAACCTCGTTTG 3′，下游5′ CTTCAATTGCTTCCCAAGGA 3′；③βactin引物序列：上游5′ GCGCTTTTGACTCAGGAT TT 3′，下游5′ CCTGGGCCATTCAGAAATTA 3′. 所有引物均由上海生物工程公司合成. 采用RTPCR和紫外图像分析技术检测小鼠肾组织IL6，IL10 mRNA表达. 实验6 in后，94℃ 30 s，56.1, 57.4, 53.2℃ 30 s (IL6/IL10/βactin)，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸7 min. 取IL6，IL10 和βactin PCR产物各3 μL， 加样于20 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳， 用凝胶成像系统定量分析DNA含量， 以所测得积分吸光度与内参照βactin积分吸光度的比值代表半定量值. 统计学处理：计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较用SNKq检验(StudentNeanKeuls法). 统计结果以Plt;0.05为有统计学意义. 所有数据采用SPSS 13.0统计软件包处理. 2结果 2.1尿蛋白含量SSd治疗Ⅰ组和SSd治疗Ⅱ组尿蛋白含量低于空白对照组(Plt;0.05)； SSd治疗Ⅱ组尿蛋白含量低于Ⅰ组(Plt;0.05, 表1). 表1各组小鼠尿蛋白含量 2.2SCr, CS和AdsDNA水平实验6 wk后，与空白对照组相比，SSd 治疗Ⅰ组和Ⅱ组SCr和AdsDNA水平均降低(Plt;0.05)，CS水平升高(Plt;0.05)；与 SSd 治疗Ⅰ组相比，SSd治疗Ⅱ组CS水平升高(Plt;0.05)，AdsDNA水平降低(Plt;0.05)，而SCr水平下降不明显(Pgt;0.05, 表2).表2各组小鼠SCr, Cs和AdsDNA水平 2.3肾组织学检查实验6 wk后，光镜观察可见SSd 治疗Ⅰ组和Ⅱ组与空白对照组相比，肾小球内皮细胞和系膜细胞增生、变性、渗出、硬化和足突融合现象得到改善，肾小管受损百分比降低(Plt;0.05, 表3, 图1). 表3各组小鼠肾组织染色肾小球评分及受损肾小管比例电镜检查可见,Ⅰ组和Ⅱ组分别可见足细胞足突广泛性融合和节段性融合，无电子致密物沉积(如箭头所示)（图2A, B）；Ⅲ组可见内皮下、上皮下以及系膜区电子致密物沉积(如箭头所示)（图2C）. IF检测各Ig在肾小球系膜区和肾小球毛细血管壁的沉积，发现SSd治疗Ⅱ组,与SSd治疗Ⅰ组和空白对照组