植物原生质体培养和体细胞杂交.PPT

第 七 章原生质体培养和体细胞杂交（Protoplast culture and somatic hybridization）;原生质体培养;目的要求; 概述;微 丝;亚原生质体(subprotoplast):;二、发展简史;1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。 1986年：Spangenberg对单个原生质体培养获得成功。 至今原生质体培养可形成胚状体并再生植株或芽的种类已经达到367种，分布于46科，160属，其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科、蔷薇科。;植物原生质体，具有再生完整植株的能力; 为细胞融合研究提供了可能，有可能产生异源杂交新品种； 是遗传工程的理想受体系统； 是开展遗传理论研究的材料。;第一节 原生质体的分离与纯化;一、原生质体的分离;材料预处理;2.原生质体分离的方法;机械分离法：;酶解分离法： ;常用的酶种类;常用的酶浓度;渗透压稳定剂、质膜稳定剂及pH;原生质体分离过程（ 一步法—以烟草叶片为例）;过滤、离心;二、原生质体的纯化与活力测定;（一）原生质体纯化的方法;（1）原生质体溶液用400目网筛过滤; （2）离心（500～1000r/min离心5～6min）; （3）吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此2～3次; （4）用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。;洗涤液成分： 0.45mol/L 甘露醇 10mmol/L CaCl2 ` H2O 0.7mmol/L KH2PO4 洗涤液pH： 5.6;2.漂浮法; 3 .界面法;（二）原生质体活力测定;2.染色识别;（二）原生质体活力测定;FDA法的原理;（二）原生质体活力测定;三、影响原生质体数量和活力的因素;酶的种类、组合、浓度;;pH;光照和温度;渗透压稳定剂;质膜稳定剂;第二节 原生质体培养;二、培养基; ;1.液体浅层培养法;用培养基离心;优点： 原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点： 原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。;2.双层培养法—液体-固体双层培养法;优点： ??体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点： 不易观察细胞的发育过程。;3.固体薄层培养法（平板培养）;优点： 使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。;4.琼脂糖珠培养;5.饲喂层培养;四、培养条件;五、影响原生质体培养的因素;培养基营养 原生质体培养经常使用的KM-P培养基就是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS培养基为基础 改进的。 培养条件 温度，光照 植物材料和基因型 供体细胞的生长同步性;原生质体再生过程;细胞壁再生是细胞分裂的先决条件;细胞分裂;愈伤组织或胚状体形成;植株再生;;A-E, 培养的欧当归(Levisticum officinale Koch))原生质体分裂再生成植株的过程 F-L, 培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J. 2n=22，K.L.多倍体. ;;;原生质体的分离培养与植株再生(动画);第三节 原生质体融合;概念;受精和体细胞融合的区别;1、原生质体融合意义;2、成 就;3、原生质体的选择;番茄+马铃薯？;4、融合方法;4.1 无机盐诱导融合（NaNO3法）;4.2 高Ca - pH高离子法;4.3 PEG法;PEG法特点：;PEG法 原理：;;4.4 电融合法;电融合法原理：;施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。;;原生质体的融合过程包括3个主要阶段： 1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。;原生质体融合后的培养同原生质体培养;5、体细胞杂种细胞筛选;异硫氰酸荧光素（FITC） 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发出绿色和红色;;;6、体细胞杂种的鉴定;6-1 形态学;;6-2、细胞学;;6-3、遗传标记