炎症性肠病基因治疗进展.docVIP

　　炎症性肠病基因治疗进展 【关键词】 炎性肠疾病 基因治疗 0引言 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohns disease, CD)都属于炎症性肠病(inflammatory boo内稳定高效地表达目的基因. 予免疫缺陷鼠静脉注射5型重组腺病毒(AD5)载体, 亦发现结肠上皮细胞长时间表达目的基因, 而消化道其他部位目的基因表达阴性. 肠道相关淋巴组织内的免疫细胞无疑是IBD基因治疗中最受关注的靶细胞, 但由于肠道黏膜上皮屏障的存在, 载体不能有效到达固有层. M细胞是存在于黏膜集合淋巴结滤泡顶部上皮中的一种特殊细胞, 其主要功能是将肠腔内抗原和病原体跨上皮转运至上皮下淋巴组织. 可利用M细胞能广泛摄取各种抗原物质的功能,及其与免疫细胞之间的对话方式, 通过M细胞将载体导入黏膜淋巴组织, 从而调节局部黏膜免疫反应和机体的系统免疫反应［1］. 有实验表明AAV载体能感染肠道固有层内细胞, 并使17%～19%的固有层细胞于感染后6 mo内持续表达目的基因. 2目的基因转移至胃肠道组织 实验表明［2］, 阻断小鼠肝动脉和门静脉后, 经眶后静脉丛予重组腺病毒载体, 30 min后恢复肝脏血供, 肠壁血管、血管周围组织和小肠绒毛持续表达目的基因达数周之久. 局部予经包装的质粒、脂质体、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和AAV载体均能将目的基因转导至肠道黏膜,且黏液溶解剂(二硫苏糖醇、N乙酰半胱氨酸)和蛋白酶体调节剂(MG101)能促进转导效率. 上述载体中, 以AAV载体系统的应用前景最广阔. 重组AAV(rAAV)载体去除了所有编码序列, 只保留145 bp的末端重复序列, 不含任何病毒基因, 感染细胞后,前病毒DNA定向整合至19号染色体的AAVS1区域. 在人类基因治疗的常用病毒载体中, rAAV是目前唯一没有引起宿主病理反应的载体［3］. 实验表明, 以AAV载体对空腹大鼠灌胃6 h后, 胃十二指肠和近端空肠固有层细胞开始表达目的基因, 并能持续稳定表达6 mo; 虽然未观察到结肠有目的基因表达, 但是可以推测灌肠能使目的基因被转导至结肠固有层细胞. 此外, 虽然没有直接证据表明AAV载体能感染肠干细胞, 但除固有层外, 肠上皮细胞亦表达目的基因1 mo. AD5是体内实验使用最多的载体, 该载体由于E1缺失造成病毒复制缺陷. 腺病毒载体可高效感染多种靶细胞, 对分裂期细胞和增殖停止期细胞均有很高的导入效率, 这是逆转录病毒载体所不具备的. 据报道, 经十二指肠饲管予大鼠E1缺失的重组腺病毒载体后, 目的基因能有效导入十二指肠、空肠和回肠上皮细胞. 以E1/E3缺失的重组腺病毒载体灌肠后, 结肠上皮细胞能高效表达目的基因. 而且炎症性肠病的基因治疗AD5载体感染IBD患者肠上皮细胞的效率远高于非IBD患者［4］. 但是经消化道予腺病毒载体主要感染的是更新速率很快的肠上皮细胞, 因此AD5载体转导的目的基因在肠道内的表达时间只能维持数天, 为达到治疗IBD的目的, 需反复给药, 同时还要避免机体的免疫反应. 有报道称, 经尾静脉注射重组腺病毒载体后, 免疫缺陷小鼠结肠上皮细胞和隐窝细胞可长时间表达目的基因, 而消化道其他部位无目的基因表达. 该实验结果非常诱人,但由于E1缺失造成病毒复制缺陷, AD5载体不能像逆转录病毒载体一样整合至宿主基因组. 3IBD基因治疗的策略和研究现状 3.1下调促炎细胞因子的表达IL18是一个多功能细胞因子, 结构类似IL1家族, 能活化T淋巴细胞内的核因子(NF)κB和激活蛋白(AP)1, 与IL12诱导的STAT4协同促进T 淋巴细胞表达干扰素(IFN)γ［5］. 此外, IL18还通过上调TNFα，IL6和IL1的表达加剧炎症反应. 以IL18结合蛋白(IL18BP)治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠结肠炎, 可减轻肠道炎症. 鉴于IL18在CD中的重要作用, Wirtz等［6］尝试以IL18为靶点对CD动物模型进行基因治疗. 构建表达IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体, 予移植CD4+ CD62L+T淋巴细胞形成的CB.17SCID小鼠结肠炎模型灌肠. 蛋白质印迹分析显示表达IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体能抑制结肠组织产生IL18, 实验组结肠炎的内镜和组织病理学改变均较对照组明显改善. 此外, 该实验还观察到局部给药方式只抑制结肠固有层单核细胞产生IFNγ, 而不影响于脾脏的单核细胞. 3.2上调抗炎细胞因子的表达IL10能抑制巨噬细胞活化和分泌IL1α, ILβ, IL6, IL12, IL18和TNFα等细胞因子, 下调人类白细胞抗原(HLA) Ⅱ类分