用realtime RTPCR技术检测肺癌淋.docVIP

　　用realtime RTPCR技术检测肺癌淋 【摘要】 目的 评价一种简单客观敏感的检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞方法：realtime RTPCR。方法 从手术的30例非小细胞肺癌病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规病理学检查和realtime RTPCR检测CK19 mRNA的表达。从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照，用15例肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照。结果 在94(94.0%)组经组织病理学检查未发现肿瘤细胞的淋巴结中，用realtime RTPCR在26(27.7%)组检测到CK19 mRNA的表达。6组经组织病理学检查有肿瘤细胞扩散的淋巴结中全部检测到CK19 mRNA的表达。组织病理学检查22例病人为pN0期，用realtime PCR方法在这些病人中发现13(59.1%)例病人淋巴结有微小扩散的肿瘤细胞。结论 应用real time RTPCR检测CK19 mRNA的表达是一种在纵隔淋巴结发现扩散肿瘤细胞敏感而特异的方法。 【关键词】 肺癌 隐匿性微小转移 realtime RTPCR 角质蛋白19 0 引言 在经手术完全切除肿瘤的肺癌病人中，约有40%手术后两年内复发，五年的生存率仅为60%左右[1]，复发的主要原因是残留的微小转移的癌细胞不能用常规的组织病理学方法发现。 本研究使用LightCycler系统用realtime RTPCR方法检测角质蛋白19(Cytokeratin CK19) 基因在非小细胞肺癌病人局部淋巴结的表达，研究肺癌纵隔淋巴结微小转移的诊断，评价realtime RTPCR方法在检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞的敏感性和特异性。 1 材料和方法 1.1 研究的标本 实验组：从手术的30例NSCLC病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规的病理学检查和realtime RTPCR检测CK19 mRNA的表达。 对照组：①从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照； ②用15例非小细胞肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照，观察CK19 mRNA的表达。 在手术中获得的淋巴结和肿瘤组织立即放入RNA稳定溶液，储存在-20℃冰箱中。 1.2 Cytokeratin 19( CK19) 基因的检测 1.2.1 RNA的提取 提取总RNA所用试剂盒为RNeasy Midi Kit,QIAGEN。 将淋巴结(重量30～250mg) 放入液氮中速冻。在预冷的容器中研磨成细粉末，转移至15ml的试管中。加入4ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀。根据试剂盒的说明进行操作，提取总RNA。用Biophotometer仪测定RNA浓度。用无RNase水校正零点。 1.2.2 肺癌细胞A549培养与RNA提取 本研究选用NSCLC 细胞系A549。用RPMI1640加5%～10%小牛血清培养A549细胞，收集总数为5×106的细胞进行RNA提取，步骤同淋巴结的RNA提取。 1.2.3 cDNA合成 所用试剂盒为1st strand cDNA synthesis kit for RTPCR (AMV)+, Roche。在20μl的反应体系中含组织RNA 500ng，10X反应缓冲液2.0μl，随机引物p(dN)6 2.5μl，dNTPs混合液2.0μl，AMV反转录酶1.0μl，25mmol/L MgCl2 2.5μl。先将RNA变性：65℃，15min。然后加入反应混合物溶液，设定PCR仪(带热盖的自动化热循环反应仪)程序：25℃保温10min, 42℃反应1h, 95℃处理5min以变性反转录酶，然后在4℃保存1～2h或在-20℃长期保存备用。同时设阳性对照：肺癌细胞A549，阴性对照为水。 1.2.4 real time PCR 所用的引物为Cytokeratin19 (CK19), 参考基因为Cyclophilin B (CPB)，所用试剂盒为LightCyclerCK19 quantification kit, LightCyclerCPB quantification kit。LightCycler faststart DNA master SYBR green 1 kit( Search GmbH公司，Heidelberg, 德国)。 ①建立反应体系，在无菌离心管中加入以下反应成分，见表1。 ②real time PCR反应： 使用LightCyclerTM PCR表1 PCR反应混合物溶液 反应物体积（μl） PCR等级水12.0LC 引物2.0LC DNA Master SybrGreen I2.0模板4.0总体积20.0 仪， 设定程序： 变性： 95℃ 10min， 延伸 95