用积分法考察黄嘌呤对Candida specie.docVIP

　　用积分法考察黄嘌呤对Candida specie 【关键词】 尿酸酶 Characterization of inhibition of xanthine on Candida species uricase by integrated method 　　【Abstract】 AIM: To investigate the prerequisite of the integrated method for characterizing inhibitors odel. METHODS: Uricase reaction curve onitored by absorbance at 293 nm. The apparent kiic parameters (apparent MichaelisMenten constant, Kmapp, and apparent maximal reaction rate, Vmapp) ated by nonlinear fitting reaction curve to the integrated MichaelisMenten rate equation e. The inhibition type and inhibition constant (Ki) ined based on the responses of apparent kiic parameters to xanthine concentrations. RESULTS: Outliers in reaction curve greatly reduced the reliability of parameters obtained by this integrated method. ichaelisMenten constant, Kmapp)和表观最大反应速度(apparent maximal reaction rate, Vmapp). 据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant, Ki). 结果: 被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性. 通常终点底物lt;1/6 Kmapp而起始底物足够高，此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20％而Vmapp精度更高. 用积分法所得Kmapp与双倒数法一致，且和黄嘌呤浓度成正比，对应Ki为(5.4±0.8) μmol/L (n=3)，也与双倒数法一致. 结论: 被分析数据精度足够高，用无抑制剂时米氏常数（MichaelisMenten constant, Km）4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度lt;1/6 Km，此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂. 　　【关键词】 积分法； 双倒数分析法； 尿酸酶； 黄嘌呤； 米氏常数； 抑制常数 　　0引言 　　酶抑制剂是新药开发热点. 通常据表观米氏常数（apparent MichaelisMenten constant, Kmapp）和表观最大反应速度（apparent maximal reaction rate, Vmapp）随抑制剂浓度变化同步确定抑制类型和抑制常数（inhibition constant, Ki）筛选抑制剂［1］. 双倒数法测定Kmapp和Vmapp筛选抑制剂需要底物浓度分布在米氏常数(MichaelisMenten constant, Km)两侧，且范围应尽量宽. 此法测定动力学参数对低浓度底物下初速度误差和底物浓度本身的误差都非常敏感，用于筛选抑制剂的成本也很高. 用积分速度方程酶反应曲线，即积分法，可同步确定Km和最大反应速度(maximal reaction rate, Vm). 经典积分法所用积分速度方程自变量缺乏统计合理性，所得参数可靠性低［2］. 最近发现用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合酶反应曲线，能可靠测定酶动力学参数并筛选抑制剂［3-7］. 此积分法筛选抑制剂对初始底物浓度误差不敏感，且效率高而成本低. 我们用此积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用，以期进一步明确此法筛选抑制剂的可靠性和应用条件. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　尿酸、黄嘌呤购自I, Candida species尿酸酶(E.C 1.7.3.3)购自Sigma ［U 0880］. 其余试剂为国产分析纯. 　　1.2方法 　　缓冲液含100 μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］. 反应体系含1.0 mL缓冲液，底物、抑制剂和酶液共0.20 mL. 用双倒数法分析时，酶为0.083 μkat/L，记录反应延迟30 s后反应1 min内的数据. 积分法分析时，酶为0.333 μkat/L，初始底物浓度为55 μmol/L，在