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犬粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF）酶联免疫分析试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 检测范围：1.56 pg/ml- 100 pg/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的犬GM-CSF，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6 个月 预期应用：ELISA 法定量测定犬血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中GM-CSF 含量。 说明 ?试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 ?浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 ?中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 ?刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何 影响。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗GM-CSF 抗体的微孔中依次加入标本 或标准品、生物素化的抗GM-CSF 抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色 的深浅和样品中的GM-CSF 呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值）， 计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板（Assay plate ）： 一块（96 孔）。 2.标准品（Standard）： 2 瓶（冻干品）。 3.样品稀释液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。 4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）： 1×10ml/瓶。 5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）： 1×10ml/瓶。 6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）： 1×120μl/瓶（1：100）。 7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）： 1×120μl/瓶（1：100）。 8.底物溶液（TMBSubstrate）： 1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液（Wash Buffer）： 1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25 倍。 10. 终止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 1.标准规格酶标仪 2.高速离心机 3.电热恒温培养箱 4.干净的试管和Eppendof 管 5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6.蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置2 小时或4℃过夜后于1000 x g 离心20 分钟，取上清即可 检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 2.血浆：可用EDTA 或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 -8° C1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 3.细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将标本放 于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 标本的稀释原则： 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准 曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度 时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。 标准品的稀释原则：2 瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以上， 然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 pg/ml,，做系列倍比稀释后，分别稀释100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5pg/ml, 6.25 pg/ml, 3.12 pg/ml, 1.56 pg/ml,样品稀释液直接作为标准浓 度0 pg/ml，临用前15 分钟内配制。 如配制50 pg/ml 标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）100 pg/ml 的上述标准品加入含0.5ml 样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 生物素标记抗体的稀释原则： 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制 （每孔100μl），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素标记抗体加990μl生物素标 记抗体稀释液的比