重组鲢鱼抗菌肽parasini原核表达、纯化与抗菌活性 - 动物营养学报.pdf

动物营养学报２０１２，２４（９）：１７３１１７３６ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ 　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６２６７ｘ．２０１２．０９．０１６ 重组鲢鱼抗菌肽ｐａｒａｓｉｎ原核表达、纯化与抗菌活性 Ⅰ １ １ １ １ １，２ １ 赵　华 　张艳艳 　汤加勇 　李　珂 　周继昌 　王康宁 （１．四川农业大学动物营养研究所，成都 ６１１１３０；２．深圳市慢性病防治中心分子生物学实验室，深圳 ５１８０２０） 摘　要：本文旨在构建抗菌肽ｐａｒａｓｉｎ 大肠杆菌重组表达载体，表达人工重组ｐａｒａｓｉｎ ，并检 Ⅰ Ⅰ 测其抑菌活性。根据ｐａｒａｓｉｎ 的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性，人工合成１段５７ｂｐ的 Ⅰ 基因编码ｃＤＮＡ，通过ＰＣＲ技术构建大肠杆菌重组表达质粒ｐＥＴ３２Ｐａｒａ ，并在ｐａｒａｓｉｎ 基因 Ⅰ Ⅰ ５′－端引入Ｘａ因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）菌株后，在不同温度（３７ 和２０℃）条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。结果表明：ＩＰＴＧ成 功诱导了１个２１ｋｕ的融合蛋白表达，重组蛋白占菌体总蛋白质的４５％～５０％。在低温条件下 产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后，用 ａ因子进行 Χ 酶切，酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测，结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。 本试验实现了ｐａｒａｓｉｎ 的重组表达，表达产物经 ａ因子酶切后具抑菌活性。 Ⅰ Χ 关键词：抗菌肽ｐａｒａｓｉｎ ；大肠杆菌；融合蛋白；表达；抑菌活性 Ⅰ 中图分类号：Ｓ８５２．２　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００６２６７Ｘ（２０１２）０９１７３１０６ 　　抗菌肽在动物先天性免疫过程中起着重要作 存在成本高和结构变异等问题，采用基因工程重 用，是机体抵御外源病原体入侵的第一道防 组方法生产 ｐａｒａｓｉｎ 可望为其开发利用奠定基 Ⅰ 线［１－２］，具有抗菌谱广［３－５］、抗菌活力强且不易产 础。本试验根据大肠杆菌密码子偏好和鲢鱼ｐａｒａ ［６］ ｓｉｎ 肽段序列，人工合成ｐａｒａｓｉｎ 编码基因ｃＤ 生耐药性 等特点，具开发为抗生素替代品的潜 Ⅰ Ⅰ 力。抗菌肽ｐａｒａｓｉｎ 是从受伤鲶鱼皮肤黏液液中 ＮＡ，并克隆于大肠杆菌原核表达载体上，以实现 Ⅰ 分离到的一种新型抗菌肽，来源于组蛋白Ｈ２Ａ 其高效表达，可为其进一步开发利用奠定基础。 Ｎ末端的第１９个氨基酸，在其他鱼类皮肤黏液中 ＋ １　材料与方法 也有发现；分子质量为２ｋｕ，对革兰氏阳性（Ｇ ） － １．１　试剂与菌株 和革兰氏阴性（Ｇ ）菌以及真菌均有抑制作用，其 最小抑菌浓度（ＭＩＣ）为 １～４ ｇ／ｍＬ；与抗菌肽 　　ｐＭＤ１８Ｔ载体、ＤＮＡ限制性内切酶、Ｔ４Ｄ