实验一血红蛋白的测定（氰化法） - 东北农业大学食品科学与工程实验 .pdfVIP

实验一 血红蛋白的测定（氰化法） 1．实验特点 实验类型：验证 实验类别：专业基础 计划学时：3 每组人数：2 2．实验目的要求： 了解氰化法测定血红蛋白的原理，掌握人体血液样本的采集方法，分光光度法测定原理和技术。 3．实验原理： 血红蛋白在铁氰化钾和氰化钾的作用下，生成极为稳定的氰化高铁血红蛋白（红色），其颜色深浅与血红 蛋白的含量成正比。氰化高铁血红蛋白在 540nm 波长下，毫克分子消光系数为 44 ，据此，用分光光度法测 其光密度，运用消光系数作血红蛋白的定量测定。其化学反应式如下： - 1 - 铁氰化钾 氰化钾 血红蛋白⎯⎯⎯⎯→高铁血红蛋白⎯⎯⎯→氰化高铁血红蛋白 4．实验仪器设备： 10μL 血色素吸管（或定量毛细管） 5mL 或 10mL 带盖试管 721 分光光度计 称取碳酸氢钠 140mg、铁氰化钾200mg 、氰化钾 50mg，用蒸馏水溶解并稀释到 1000mL。贮存于棕色试 剂瓶内，在 4°C 冰箱保存，至少可稳定数月到一年。 5．材料消耗费： 10 元 - 2 - 6．实验内容步骤： 吸取 2.5mL 试剂于 5mL 带盖试管中，加入 10μL 血液，混匀后放置 15min。 选用 0.5cm 光径比色杯，与 540nm 波长下，以试剂调节仪器零点，测定各样品管的光密度。 7．注意事项： 本法为国际血液学标准化委员会（ICSH ）所推荐，具有操作简便、不需要标准、结果准确可靠等优点。 应用本法进行血红蛋白的测定，所用分光光度计的波长必需事先经过校正。 实验条件改变，如更换了光电池或灯泡、电压不稳、试剂换了批号等等均会引起光密度的改变。为了获 得正确结果，可用标准液校正或采用色泽近似的无机盐人工永久标准液来核对，这也是一种行之有效的方法。 如以上两点难以实现，宜采用标准曲线法或直接比较法进行。 血样放入试剂后形成的氰化高铁血红蛋白极为稳定，经试验，在 4°C 冰箱存放 70 天之久前后结果仍能 保持一致。为此，可将各地采集的样品在加入试剂后，在 2-10°C 环境中，集中到中心实验室进行比色测定。 - 3 - 有材料证实，取血部位对测定结果有明显影响，耳垂血的血红蛋白含量高于指尖血。 血色素吸管必须清洁与干燥，每作一份后应用水洗净后，用无水乙醇洗，最后用乙醚洗。否则取量不准， 影响结果。 8．实验结果： 将所测得的光密度乘以 73.6 即为血红蛋白的含量（g/100mL ）。 计算公式如下： D 540 ×251 64458 C HiCN × t 44 ×0.5 10000 D 540 ×73.6 HiCN Ct=待测的血红蛋白含量（g% ） D 540 在 540nm 波长下测得的氰化高铁血红蛋白的光密度 HiCN 251 ＝测定是血液的稀释倍数（血 10μL 加入试剂 2.5mL 中） - 4 - 44 ＝氰化高铁血红蛋白的毫克分子消光系数 0.5 ＝比色杯光径 64458 ＝血红蛋白的分子量 10000＝将mg/L 换算成 g/100mL 的数字 评价标准 年龄 缺乏（g/100mL ） 正常（g/100mL ） 6 个月-6 岁 11.0 11.0 6-14 岁 12.0