平成10年度大学院共通カリキュラム 神经生物学实习.pdf

平成１０年度大学院共通カリキュラム 神経生物学実習 テーマ：遺伝子導入 遺伝子導入は、本来その遺伝子を発現していない細胞に外来性の遺伝子を導入 し、細胞が本来持つ蛋白発現機構を利用して、目的の蛋白を発現させる技法で ある。この実習では、クラゲの蛍光蛋白GFP及び神経系のアクチン結合蛋白ド レブリンを線維芽細胞に発現させる。 達成レベル 本実習では、いわゆるクローニング等の分子生物学の技術は必要としない。購 入するなり、贈与されるなどして、目的蛋白の遺伝子が組み込まれている発現 ベクターを既に所持していることを前提とし、簡単な、分子生物学と培養の技 術を修得することにより、遺伝子導入を行えるようになることを目的とする。 第一日：プラスミド増殖 大腸菌培養用の培地作製 　そのまま溶かせばpHは約7になるものの、bacto-tryptoneやbacto-yeast extractにはほとんどpH緩衝能がない。従って、培地の場合pHを合わせないこ とが多い。 　使用する水はRO（逆浸透圧）水または脱イオン水とし、Milli-Q水は用いない。 Milli-Q水は高価（コーラよりも高いと言われている）である上に、あまりにも 純粋なために菌の培養には適さないからである。 　Terrific Broth では確かに菌は良く生えるが、プラスミドが抜け落ちている こともある。従って、プラスミドを増やすときはLB Mediumを用いた方がよい。 液体培地 LB Medium / liter bacto-tryptone 10g bacto-yeast extract 5g NaCl 5g （NaOHでpH を7.0～7.5 に合わせメスアップ後、）オートクレーブ。 NZYM M edium / liter NZ amine 10g NaCl 5g 1 bacto-yeast extract 5g M gSO4 7H2O 2g NaOHでpH を7.0～7.5 に合わせメスアップ後、オートクレーブ。 Terrific Broth / liter bacto-tryptone 12g bacto-yeast extract 24g glycerol 5.04g 900mlにメスアップ後、オートクレーブ。手で持てる程度に冷めたら以 下のリン酸バッファーを100ml加える。 Phosphate buffer for Terrific Broth / 100ml KH2PO4 2.31g (170mM) K2HPO4 12.54g (720mM) SOB M edium / liter bacto-tryptone 20g bacto-yeast extract 5g NaCl 0.5g 250mM KCl (1.86g /100ml) 10ml HClでpH を7.0 に合わせメスアップ後、オートクレーブ。使う直前に 2M MgCl2 (19g/ 100ml) を5ml加える。 SOC M edium / liter オートクレーブしたSOB Mediumが手で持てる程度にまで冷めたら、 20 mlの1 M glucose (18g/100ml　濾過滅菌)を加える（最終濃度 20 mM）。使う直前に2M MgCl2 (19 g / 100 ml) を5ml加える。 2xYT Medium / liter bacto-tryptone 16 g bacto-yeast extract 10 g NaCl 5g NaOHでpH を7.0 に合わせメスアップ後、オートクレーブ。 2 固形培地 アガープレートは 1.5%のbacto-agar トップアガロースは 0.7%のagarose をオートクレーブ直前に加える。 　90mmプレート1枚当たり25mlかそれ以上の培地を注ぐ。（注いでいる培地 がプレート全体に行き渡ったときが約25mlに相当する）。150mmプレートは 80ml以上。泡が生じてしまったら培地が固化する前にバーナーかライターの炎 で焼けば消える。将来トップアガロースを用いる可能性のある場合は、特に水 平