人类与医学遗传学6基因功能研究策略2015.pptVIP

* * 二维电泳: 从两种不同的条件中的细胞或组织中收获并溶解蛋白,蛋白粗提物首先根据等电点经过一维电泳分离,然后经过还原和烷化通过SDS根据蛋白分子量大小分离.胶固定后经银染显色,银染不如染色定量准确,但是更为敏感,且适于质谱分析.染色的后蛋白点被纪录并定性.感兴趣的蛋白可以切下后经质谱分析. * * RNAi的应用 基础研究： 降低基因表达(Gene knockdown) 临床应用 抗肿瘤、抗病毒….. III：蛋白质水平 蛋白质是生物活动的主要执行者 结构蛋白 酶 激素 神经递质 受体 抗体 转录因子 …… 蛋白质研究手段 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS)； 双向电泳（等电聚焦+SDS)； 质谱； Western印迹； 免疫组化； …… SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以根据电荷和分子质量的差异来分离蛋白质。 当阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低乃至消除。 同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-蛋白质复合物电泳时的泳动率差异，就反映了分子质量的不同。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳，利用等电点不同分离蛋白质。(水平，X-轴） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：利用分子量大小不同分离蛋白质。（垂直，Y-轴） 二维 (Two dimensional) 凝胶电泳 二维 凝胶电泳 等电点由低到高 分子量由高到低 质谱，顾名思义就是可以测量物质质量的仪器。蛋白质或者蛋白酶降解的多肽片段可以通过质谱仪绘制出各组分的分子量图谱，然后对比数据库中的蛋白质或其降解肽段的质量，从而推算被测定蛋白质的身份(identity)。 质谱技术 二维电泳和质谱结合分析蛋白质功能示意图 Western 印迹 目的蛋白 一抗 酶标的二抗 免疫组化Immnuohistochemistry 免疫组化 IV：蛋白质相互作用 研究一个蛋白质与一些已知蛋白质之间的相互作用，可以推断该蛋白质的生理生化功能。研究蛋白质相互作用的方法主要有： 亲和层析 Co-Immunoprecipitation Yeast Two-hybrid Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Surface Plasmon Resonance (SPR) 亲和层析 将目标蛋白固定在亲和层析介质上(如Sepharose 4B)，让细胞蛋白通过层析柱，与目标蛋白结合的蛋白质被留在层析柱上，然后洗脱下来，用质谱分析等方法进行鉴定。 免疫共沉淀 (co-immunoprecipitation，co-IP) 利用抗原和抗体间的反应特异性，用抗体将目标蛋白以及与目标蛋白相互作用的蛋白质共同沉淀下来的方法。 免疫共沉淀 酵母双杂交系统是在1989年由纽约州立大学的Stanley Fields等初步提出并建立的，是在酿酒酵母中研究蛋白质之间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。 将相互作用的两个蛋白质分别与转录因子的DNA结合域 (DNA-binding domain)和转录激活域(Activation domain)融合，在酵母细胞中通过报告基因的表达情况反映两个蛋白质之间的相互作用。 酵母双杂交技术 酵母双杂交原理 酵母双杂交筛选 Surface Plasmon Resonance (SPR，表面等离子体共振) One interaction partner (Y) is bound to the metal film while the other (red balls) partner Is injected over the surface. Amount of bound protein is quantified based upon angle of reflected light. Real time association and dissociation of a protein-protein interaction can be quantified. Surface Plasmon Resonance (SPR) F?rster/Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) A non-radiative, dipole-dipole coupling process, transfer energy from an excited donor fluorophore to an acceptor flu