单链寡核苷酸在Hela及Human Liver细胞系EGFP荧光报告系统中的定点纠错分析.pdfVIP

主里垃塑匿型盔堂堕主堂垡坠塞 LNer细胞系 苎竺塞堕嘏在Hela及Human EGFP荧光报告系统中的定点纠错研究 摘 要 { ／ f基因治疗是指改变活细胞遗传物质的一种医学治疗方法，即采用分子生物学的方法 一～～一一- 和原理，在核酸水平上开展疾病治疗。自1990年9月首例患者接受基因治疗以来，已 有数千名患者接受了基因治疗，但无一例能产生明显疗效。主要问题在于基因治疗的安 全性，效率，伦理道德及靶向性问题，均未得到有效解决。其中靶向性问题关系到外源 基因能否被导入到特定的细胞，并进一步在基因组上的特定位点发挥作用，是基因治疗 成功与否的关键。广义上，靶向性基因治疗还包括另外三个水平：在组织水平上，将目 的基因导入特异性的靶组织或靶器官；在基因水平上，将目的基因整合到基因组上的特 定位点；在表达水平上，调控目的基因在特定的时机表达。而狭义的靶向性基因治疗， 仅指基因水平上的靶向性治疗。基因组水平上的靶向性治疗即目的基因在基因组上的 特异性整合与纠错，包括基因原位置换和原位基因修复。RNA／DNA嵌合寡核苷酸，以 及硫代修饰的单链寡核苷酸最近被用于基因定点纠错。RNA／DNA嵌合寡核苷酸由68 个碱基组成的单链寡核苷酸，其自身可折叠形成双链结构。双链区与基因组中靶序列有 25 nt的同源序列，在组成该同源区的双链中，一条链全由DNA组成，另一条链由2段 各10个碱基的RNA及中间的5个碱基的DNA组成。同源序列与基因组中靶序列相比， 只有一个碱基不配对，该错配碱基位于同源序列中间。同时2．0．甲基化修饰RNA残基 以防止RNase H对RNA／DNA杂合链的降解；在双链的两端各有一个由4个T碱基组 成的发卡环结构，赋予这种双链拓扑学上灵活性：同时在3’端引入5个配对的GC桥稳 定这种二级结构，同时使得单链寡核苷酸的5’与3’端相邻排列，中间仅存在一个缺口。 RNA，DNA嵌合寡核苷酸最初因其有效性引起人们关注，但随着研究工作的深入，人们 发现用单链寡核苷酸也可得到与嵌合寡核苷酸接近的效率。由于单链寡核苷酸具有成本 、 低，质控好的优势，现多集中于单链寡核苷酸的研究，尤其是硫代寡核苷酸的定点纠错。扩 ／ 在本研究中，应用我们实验室已有的Hela．F5突变EGFP荧光报告系统，及新建 !里垃塑堕型盔兰擅圭堂堡鲨塞 Livercell 的Human 饰的寡核苷酸的定点纠错作用。突变EGFP荧光报告系统的优势在于，可以通过荧光 显微镜和流式细胞仪在细胞水平观察纠错情况，较DNA水平测定纠错效率，更直观， 更迅速。在肝脏细胞系中建立此报告系统，将有助于本实验室通过寡核苷酸治疗鸟氨 酸氨甲酰转移酶缺陷症(OTC，omithine transcarbamylase 谢性疾病。由于甲基化尿嘧啶修饰的单链寡核苷酸的最适长度为45nt，因此推测硫代 修饰的寡核苷酸的适宜长度也为45nt。1或2个硫代修饰的寡核苷酸较3或6个硫代 修饰的寡核苷酸毒性小。结果显示，45nt长1或2个硫代修饰的寡核苷酸纠错效率低 于25nt含6个硫代修饰的寡核苷酸，而相当于或略高于25m含3个硫代修饰的寡核 苷酸。纠错效率是判断寡核苷酸优劣的重要因素，但不是唯一因素。6个硫代修饰的 寡核苷酸对细胞毒性大，因此并不适合作治疗工具。在不同长度，含不同硫代修饰的 寡核苷酸中，寻找效率与毒性之间的平衡点至关重要。另外，本实验在肝脏细胞系(HL cell lines)中进行硫代寡核苷酸的壅盛塞銮，为治疗鸟氨酸氨甲酰转移酶缺陷症等点 突变遗传代谢性疾病打下了基础。 主垦垫塑垦登盔兰堕主堂垡笙皇———————————————