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科学故事：一级结构决定高级结构 蛋白质的高级结构由其一级结构决定的学说最初由Christian B. Anfinsen 于1954 年 提出。在1950 年之前，Anfinsen 一直从事蛋白质结构方面的研究。在进入美国国立卫 生研究所（NIH ）以后，继续从事这方面的研究。当时他最想知道的是：一个蛋白质是 如何折叠成它独特的三维构象的？需不需要其他酶的帮助？蛋白质为什么要采取特定 的构象？ Christian B.Anfinsen 然而，要想了解蛋白质的折叠过程，首先需要建立一种方法能够测量或评估蛋白质 的构象，其次还需要找到一种手段用以检测折叠过程。Anfinsen 以牛胰核糖核酸酶 （ribonuclease ）为研究对象轻而易举地解决了第一个问题（实际上选用此酶的部分原因 是当时的芝加哥肉类加工公司能够为他的实验室随时提供足够的原材料），因为核糖核 酸酶催化RNA 的水解，其酶活性完全取决于其特定的三维构象，于是酶活性成为测量 这种蛋白质采取何种构象的一种方法。但要观测折叠过程既可以从一个新合成的尚没有 折叠的蛋白质开始，也可以在体外将一个已折叠好的蛋白质去折叠（unfold ），然后再 观察它的再折叠（refold ）过程。Anfinsen 选择了后一种途径。事实上，这种酶特别适 合用后一种途径进行研究，首先因为二硫键是决定其分子形状的主要因素。另外，此酶 是一种单纯蛋白质，只有124 个氨基酸残基组成，含有4 个二硫键，而且其活性很容易 通过测定水解RNA 释放出来的核苷酸量来测定。Anfinsen 和两个博士后Michael Sela 、 Fred White 在研究中发现，使用高浓度的巯基试剂——β- 巯基乙醇（β- mercaptoethanol ） 可将二硫键还原成自由的巯基，如果再加入尿素，进一步破坏已被还原的核糖核酸酶分 子内部的次级键，则该酶将去折叠转变成无任何活性的无规卷曲。对还原的核糖核酸酶 的物理性质进行分析的结果清楚地表明了它的确采取的是无规卷曲的形状。 在成功得到一种去折叠的核糖核酸酶以后，Anfinsen 着手开始研究它的重折叠过程了。 考虑到被还原的核糖核酸酶要在已被还原的8 个Cys 残基上重建4 对二硫键共有 105 种不 同的组合，但只有一种是正确的形式，如果决定蛋白质构象的信息一直存在于氨基酸序列之 中，那么，最后重折叠得到的总是那种正确的形式。否则，重折叠将是随机的，最后只能得 到少量的正确形式。显然，第一种情形能完全恢复去折叠过程中丧生的酶活性，而后一种情 况只能恢复很少的酶活性。 Anfinsen 的重折叠实验还是比较顺利的，他通过透析的方法除去了导致酶去折叠的 尿素和巯基乙醇，再将没有活性的酶转移到其生理缓冲溶液之中，在有氧气的情况下于 室温放置，以使巯基能重新氧化成二硫键。经过一段时间以后，发现核糖核酸酶活性得 以恢复，这意味着它原来的构象恢复了（图2-47 ）。由于上述过程没有细胞内任何其他 成分的参与，完全是一种自发的过程，因此，有理由相信此蛋白质正确折叠所需要的所 有信息全部存在于它的一级结构之中。很快，Anfinsen 的研究成果被发表在1954 年 《生 物化学杂志》（Journal of Biological Chemistry ，JBC ）上。进一步的实验确定了变性的 核糖核酸酶完全恢复其活性的条件，在此基础上，Anfinsen 提出了蛋白质折叠的热力学 假说（thermodynamic hypothesis ）。根据此假说，一个蛋白质的天然三维构象对应于在 生理条件下其所处的热力学最稳定的状态。热力学稳定性由组成的氨基酸残基之间的相 互作用决定，于是蛋白质的三维构象直接由它的一级结构决定。 图2 －47 牛胰核糖核酸酶的变性和复性实验 尽管Anfinsen 的工作奠定了蛋白质折叠的热力学基础，他也因此获得了1972 年的诺贝尔 化学奖，但是蛋白质折叠是相当复杂的。到现在为止，我们仍然不能根据一个蛋白质的一级 结构推断出它的三维结构。同时，还必须注意到，蛋白质在体外的折叠比在细胞内的折叠要 慢得多！