8 植物胚培养.pptVIP

第九章　胚培养 植物胚培养技术概况: 　　　1904年由汉宁（Hanning）首先做了试验。他把萝卜和辣根菜未成熟的胚培养在含有蔗糖、无机盐、氨基酸和植株提取液的各种培养基上，结果胚得到了充分发育，并获得了可移植的实生苗。 胚培养的意义 （1）幼胚培养能克服远缘杂交的不亲和性——进行“胚营救” （2）成熟胚培养能提高发芽率。可用于抢救储藏过久或储藏不当的种子。 离体胚培养的发育途径 一是按正常胚胎发育途径形成植株。 二是胚胎脱分化形成愈伤组织。 三是胚“早熟萌发”。 材料的消毒与接种 胚培养的外界条件 光照和温度与种胚的生长发育有密切关系。对于大多数植物的胚来说，以每天12小时光照和25?C的温度较为适宜，但有些材料则需要较高的温度。如马铃薯以20?C为宜，而棉花32?C生长最好。具有休眠习性的植物种胚，接种后先在4?C温度下培养一段时间，然后转入正常温度培养效果更好。光有利于胚芽的生长，而黑暗有利于胚根的生长。因此，以光暗交替培养为好。 幼胚的培养 基本培养基 生长调节剂及其它附加物的影响 基本培养基的原理 幼胚培养需要比较复杂的培养基。因为幼胚在胚囊里生长时是处于异养状态，幼胚的生长发育不仅依赖于它们细胞间的代谢，而且还依赖于周围胚乳的丰富营养。所以，要使离体胚能继续发育至成熟胚，必须尽可能提供与幼胚相似的环境条件。 培养基的渗透压 对幼胚的继续发育有密切关系。因为幼胚是“浸泡”在具有高渗透压的胚乳液里，离体后幼胚若突然移植于低渗透压的培养基中，往往会造成幼胚生长停顿，甚至导致幼胚死亡（糖浓度过低还会引起胚早熟萌发）。培养基的渗透压一般用蔗糖来调整，也可用葡萄糖或果糖，用量在8%—10%左右。幼胚的不同发育阶段，对培养基的渗透压要求不一，随着胚的发育，对渗透压的要求降低，因此蔗糖的浓度也须降低。 生长调节剂及其它附加物的影响 生长素和细胞分裂素要配合使用 添加复杂的天然植株提取液，如椰子、香蕉、南瓜等提取液。 维生素对于已经萌发的胚的生长并非必需，而对于发育初期的幼胚的培养来说，则必须加入一些种类的维生素，如硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。 胚培养中，通常还可在培养基中加入活性炭。 接种和培养 幼胚培养直接出苗：剥胚法 切胚法 胚乳保姆法 胚培养诱导愈伤组织和植株再生 剥胚法 左手拇指和食指捏住消毒过的种子，盾片部位向上并面向接种者，右手用尖头镊子或解剖针挑破盾片部位外皮，再剥去内皮，轻轻挤压胚，用镊子尖粘住，盾片面向下接种在N6、B5 (表9-1)培养基上。置于培养箱或培养室，培养温度22—24?C，每天光照8—10小时，光照强度2000勒克斯。接种2—3天后多数能萌发，出苗率85%以上。 切胚法 种胚发育不良，盾片部位无明显突起的采用此法。把消过毒的种子切去1/3—1/2具冠毛的一端，切面向下（不要没入培养基中），接种在N6或B5培养基上。培养条件同上。此法出苗比剥胚法慢。发育差的胚接种后15—30天甚至更长的时间才能萌发，出苗率15%—30%；发育好的胚7—20天可萌发，出苗率60%以上。 胚乳保姆法 杂种在0.4mm以上可采用此法。胚乳比要接的杂种胚老2—5天效果较好。把欲取胚乳的种子消毒后，在解剖镜下将种子胚部的种皮去掉，然后去掉胚，挤出活体胚乳，接种在N6或B5 或“T+K”培养基+0.5mg/L赤霉素（GA）+0.5mg/L吲哚乙酸（IAA）+400mg/L水解乳蛋白（LH）培养基表面。然后把按照“剥胚法”剥出的杂种胚准确地移植于胚乳上原来胚的位置上。在18—20?C的温度下暗培养一星期左右，多数萌发；然后在22—25?C的温度，2000—3000勒克斯的光照强度，每天12小时光照下生长。 胚培养诱导愈伤组织和植株再生 愈伤组织的诱导 将按照“剥胚法”剥出的种胚，接种到MS无机成分+150mg/L DL-天冬素+0.5mg/L盐酸硫胺素（VB1）+1—2mg/L 二氯苯氧乙酸(2,4-D)+20g蔗糖和适量琼脂，pH值5.7的诱导愈伤组织培养基上。置于温度为26—27?C的培养室，每天光照10—12小时，光照强度2000勒克斯。5—6天后可产生肉眼可见的乳黄色愈伤组织，15—30天左右，从这些愈伤组织的局部产生出乳黄色、质硬、形状似小米粒的全能性愈伤组织。25天后将其分成2—3mm的小块，转移在MS继代培养基上（上述成分中2,4-D浓度减为0.5mg/L），培养条件同上。在继代培养基上，愈伤组织迅速增殖并产生许多绿色芽