芽胞杆菌bh072产生的抗真菌肽研究the antifungal peptides .pptVIP

16S Ribosomal DNA sequence analysis 8F （5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’） 1492R（5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’） The PCR amplification system :25μ L system, 0.2 μ L Taq enzyme ( 0.5 U/mL ) 2.5 μ L 10× Buffer 1.8 μ L Mg2+ 1 μ L dNTPs Mixture 1 μ L template DNA 0.5 μ L forward primer ( 10 μ mol/L ) 0.5 μ L reverse primer ( 10 μ mol/L ) 17.5μ L ddH2O 16S Ribosomal DNA sequence analysis Amplification factor: 95 ° C 3 min; 95° C 30 s, 55 °C 60 s, 30 cycles 72 ° C 60s, 72 ° C 5 min, 4 ° C termination reaction. Part 3 PCR analysis Primer design iturinA gene 上游引物：5’- atgaaaatttacggagtatatatg - 3’ 下游引物：5’- ttataacagctcttcatacgtt - 3’ 扩增长度：675 bp tasA gene 上游引物：5’- atgggtatgaaaaagaaattaag - 3’ 下游引物：5’- ttagtttttatcctcactgtga - 3’ 扩增长度：786 bp The PCR amplification system :25μ L system, 0.2 μ L Taq enzyme ( 0.5 U/mL ) 2.5 μ L 10× Buffer 1.8 μ L Mg2+ 1 μ L dNTPs Mixture 1 μ L template DNA 0.5 μ L forward primer ( 10 μ mol/L ) 0.5 μ L reverse primer ( 10 μ mol/L ) 17.5μ L ddH2O Sequence of the amplified PCR product was determined. Sequences of 675 bp fragments showed elevated similarity (99%) with the gene-encoding iturinA, and only 10 point mutations were observed. Sequences of 786 bp fragments showed elevated similarity (99%) with the gene-encoding tasA, and only 10 point mutations were observed. Separation and purification Crude extraction stage ammonium sulphate precipitation 硫酸铵沉淀法。该法是细菌素粗提阶段最常用的一种有效方法,其优点在于成本低,操作简便, 条件温和, 不改变蛋白质活性。 organic solvent precipitation 有机溶剂沉淀法。该法的优点在于有机溶剂不会残留在细菌素中,容易蒸发除去。有机溶剂沉淀法比硫酸铵沉淀法容易使细菌素变性,所以很少使用。 pH absorption 在细菌素粗提阶段, 如果对细菌素的性质不了解时, 可以首先采用硫酸铵分级沉淀法, 如果细菌素具有吸附性,可采用吸附法提取细菌素。也可根据实验要求,采用几种方法相结合对细菌素进行粗提。 Purification stage gel chromatography 是利用蛋白质分子量大小的差异来得到目的蛋白的一种方法。 ion-exchange chromatography 根据蛋白质所带电荷的性质与离子交换剂的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。大多细菌素带正电荷,在细菌素纯化时常常选择阳离子交换剂。 HPLC 纯度达到99 %以上 Methods and Results Bacterial strains and growth conditions Bac 14B from B. subtilis 14B strain pH7.2 and 37°C LB (peptone, 10