dna链的末端合成终止法.ppt

与DNA结构研究有关的工具酶 牛胰脱氧核糖核酸酶，简称DNaseⅠ 牛脾脱氧核糖核酸酶，简称DNaseⅡ 限制性内切酶，简称RE 蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶 回文序列 所谓回文序列就是指DNA某一片段旋转180。后,顺序不变的序列，回文序列中的单链可形成发夹结构。双链可形成十字架结构。这种发夹结构或十字架结构在大肠杆菌细胞DNA中已有发现. 核酸分子中的回文序列 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis 一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理 (1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列,如下图所示： 使核苷酸链断裂的反应 硫酸二甲酯 + 加热及哌啶使G脱落并使多核苷酸链在G位断裂 硫酸二甲酯 + 甲酸使A、G分开，加哌啶使A脱落 肼+哌啶使C、T断裂 2mol/L NaCl + 肼，使C断裂 二、DNA链末端合成终止法 又称Sanger法，其基本原理如下： 2’，3’-双脱氧核苷酸（ddNTP） 无3’碳原子上的羟基，故不能与下位核苷酸形成磷酸二酯键。 DNA合成反应在此终止。 DNA链末端合成终止法基本原理 DNA链末端合成终止法基本流程 * 二、核酸的一级结构 核酸中核苷酸的排列顺序/碱基序列。 连接键： 3，5 磷酸二酯键 方向性： 5→3 定义： * A G P 5? P T P G P C P T P OH 3? 书写方法 5? pApCpTpGpCpT-OH 3? 5? A C T G C T 3? 简化： 再简化： * 核酸分子大小表示法： 碱基数目表示 base、 kilobase、用于单链DNA或RNA 碱基对数目 base pair(bp), kilobase pair(kbp)用于双链DNA或RNA 小的核酸片断（小于50bp）称寡核苷酸 核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法) 2’，3’-双脱氧核苷酸（ddNTP） A G C T DNA-Pol dNTPs DNA-Pol dNTPs DNA-Pol dNTPs DNA-Pol dNTPs 引物 待测序模板DNA 各管分别加入四种ddNTP ddATP ddGTP ddTTP ddCTP 待测DNA模板： 3’—TTGCACCTGA—5’ 引物：与模板3’端互补 DNA聚合酶（DNA-PolⅠ） dNTP底物（其中一种用32P标记） 四个试管中分别加入，反应一段时间。 ddG ddA ddT ddC 电 泳 三、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。 用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸； 然后进行Sanger测序反应； 反应产物经电泳（平板或毛细管电泳）分离； 通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 DNA自动测序结果举例