福建省农业科学院微生物科技创新团队 - yzxzcom.doc

福建省农业科学院微生物科技创新团队 2015年度研究工作计划四色表 接受任务 姓 名 潘志针 学历职称 硕士/助理研究员 团队职责 研究项目 主持项目： 益生菌促进发酵床养猪免疫功能的研究（2015R1018-10）[潘志针 省属公益类科研院所基本科研专项] 参与或协助项目： 基于生物藕联技术的蛋白修饰对Bt杀虫活性增效机理的研究[朱育菁，国家基金] 功能性微生物制剂在农业副产物资源转化中的研究与应用示范（201303094）[刘波， 农业部公益性行业专项] 植物源微生物功能胶高产高效菌株的引进、创制与应用（2014-Z48）[朱育菁，农业部948项目] 公共事务 负责实验室公共仪器的申报、采购、维修、保养和入库等。修理电路跳闸问题10余次，修理灭菌锅、摇床、水龙头漏水等问题10余次。更换离心机压缩器等。 协助仪器室的安全管理 协助所领导和课题组负责人完成一些日常工作安排。 基本任务 论文 试验 专利 下乡 报告 工作计划 科研计划 利用转录组学，研究Cry2Ab藕联修饰前后，靶标害虫mRNA表达差异，寻找差异基因，验证藕联配基能否能通过信号传导途径加强藕合型毒素杀虫毒力的机制。 研究藕合型生物毒素的生产工艺。 利用荧光标记、荧光淬灭技术，交联质谱，X-晶体衍射技术研究藕合型生物毒素的藕合位点及藕合结构图。 事务管理 实验室公共仪器的申报、采购、维修、保养和入库等。 协助仪器室的安全管理 协助所领导和课题组负责人完成一些日常工作安排。 年度考核 科研小结 一、Cry2Ab30的活化机制以及活化对杀虫毒力的影响 1、Cry2Ab能够被中肠液活化 图1 不同比例（中肠液：Cry2Ab）对Cry2Ab的活化 实验表明Cry2Ab能被小菜蛾中肠液活化，在中肠蛋白酶的作用下N端被切除，形成55kDa的杀虫蛋白。但是Cry2Ab 在哪个位点被切开？被什么酶切开？酶切对Cry2Ab功能的发挥是否必须？这些均未见报道，因此我们进行了以下的研究。 2 N端测序鉴定Cry2Ab的酶切位点 图2 N端测序鉴定 首先我们通过N端测序进行了Cry2Ab酶切位点的鉴定，实验结果如图2所示，总共进行了5轮反应。进一步结合Cry2Ab氨基酸序列进行分析，确定了酶切位点为139位的胰蛋白酶酶切位点和144位的糜蛋白酶酶切位点，分别利用胰蛋白酶和糜蛋白酶对Cry2Ab进行酶切，发现均可以对Cry2Ab进行活化（图3）。 3 N端测序结果分析 图3 酶切位点分析与验证 4 蛋白酶抑制剂确定酶切位点 图4 不同抑制剂对Cry2Ab 活化的抑制作用 通过不同蛋白酶抑制剂添加确定只有丝氨酸蛋白酶能抑制Cry2Ab的活化，而胰蛋白酶和糜蛋白酶都是丝氨酸蛋白酶，因此确定酶切位点为胰蛋白酶和糜蛋白酶（图4）。 5 定点突变构建不能被中肠液活化的Cry2Ab突变体 图5 Cry2Ab 定点突变 通过引物设计、PCR、酶切验证以及测序成功得到了139,144以两个位点均发生突变的Cry2Ab突变体（图5）。将其转入BL21菌株，表达纯化Cry2Ab蛋白。实验结果表明Cry2Ab突变体和野生型蛋白分子量没有发生变化，全波长扫描结果也表明突变后Cry2Ab的结构没有发生明显变化（图6）。 图6 Cry2Ab突变体表达及结果检测 6 Cry2Ab突变体生物学活性 通过中肠液对Cry2Ab突变体及野生型蛋白进行活化，发现只有两个位点都发生突变的Cry2Ab才不能被活化，单点突变和野生型蛋白均能被活化，进一步进行了杀虫实验，实验结果显示，单点突变和野生型毒力相当，而两点突变的Cry毒素毒力则大幅度下降。我们的这个结果表明Cry2Ab N端的切除对于其毒力的释放是必须的。同时Cry2Ab毒力的释放和在哪个位点切割无关，和能不能切割有关，能切割，就产生毒力（图7）。 图7 Cry2Ab突变体活化及其杀虫毒力测定 7 活化不能提高Cry2Ab与中肠BBMV的结合 Cry毒素通过和膜受体相互作用，最终在细胞膜上形成孔道。Cry毒素活化后是不是通过提高了与BBMV的结合能力，从而提高杀虫毒力，因此我们检测了Cry毒素和活化毒素与BBMV的结合能力。实验结果如图，无论是octet 还是ligand blot，都表明活化后Cry毒素没有提高与BBMV的结合能力（图8）。 图8 Cry2Ab原毒素和活化毒素与BBMV的相互作用 8 活化能提高Cry2Ab寡聚化能力 通过查阅文献我们发现，Cry毒素通过形成中间有孔道的多聚体复合物，铆钉在膜上，形成孔道。那我们就检测看看Cry毒素活化后是否能提高形成这种多聚体的能力。我们通过native检测了Cry毒素是否能形成多聚体。那我们的结果就表明，原毒素只能形成2具体，而活化后就可以形成4聚体，而且当我