NanoDrop蛋白质测定指南346.docxVIP

NanoDrop 2000/2000c在蛋白分析中的应用下表是使用了Thermo Scientific的NanoDrop紫外分光光度计做蛋白质检测中一个非常有用的指南。比色分析法如Pierce 660 nm, BCA, Bradford 和Lowry法，通常用在未知蛋白溶液和溶菌液分析中。蛋白质含有色氨酸、酪氨酸残基或半胱氨酸二硫键，这些物质在280nm下有强的紫外吸收，使用NanoDrop2000/2000c软件A280的蛋白质应用模块，可以建立一个纯蛋白在280nm下比色的快速传统的蛋白质定量方法。方法检测下限检出上限方法优点方法缺点方法类型/计算Pierce 660 nm50 ug/mL(15:1 试剂/样品体积) **********25 ug/mL(7.5:1试剂/样品体积)2000 ug/mL**********1000 ug/mL快速，简单最正确的全蛋白分析Compatible withLaemmli loading buffer as well asmany detergents and reducingagents.储藏和分析室温下进行。不同蛋白之间测试结果有所不同，但可作为Bradford法的一个很好的不错的补充比色法，需要标准曲线BCA0.2 mg/mL(20:1试剂/样品体积)**********0.01 mg/mL(1:1试剂/样品体积)8 mg/mL**********0.2 mg/mL不受大多数表面活性剂影响(浓度高达5%).与考马斯亮蓝方法相比，不同蛋白质直接的差异更小铜螯合剂，还原试剂和高缓冲能力溶剂可能会影响BCA分析比色法，需要标准曲线Bradford100 ug/mL(50:1试剂/样品体积)**********15 ug/ml(1:1试剂/样品体积)8000 ug/mL**********100 ug/mL快速简单，室温下操作表面活性剂可能导致试剂发生沉淀。考马斯亮蓝法产生不同蛋白之间数据差异性是BCA法的两倍比色法，需要标准曲线ModifiedLowry0.2 mg/mL4.0 mg/mL可以在650nm到750nm之间任意波长下测试，而很少有吸光度强度丢失；优化的波长测试中采用750nm，因为很少有其他物质在该波长下产生吸光清洁剂或钾离子在修饰Lowry分析中会形成沉淀。清洁剂还原剂和游离thiols缓冲液同样会影响分析。比色法，需要标准曲线A2800.10 mg/mL (纯牛血清蛋白 -基座进样)0.010 mg/mL (纯牛血清蛋白-比色皿进样)400 mg/mL(纯牛血清蛋白)快速，不需要额外试剂和预处理时间，不需要做标准曲线未知蛋白或混合物蛋白分析中可能会产生相当大的误差。有紫外吸收能力的非蛋白成分（如核酸、细胞溶解产物）会影响分析结果吸光度比尔定律.非标准曲线蛋白比色法Pierce660 nm蛋白质分析法标准曲线的线性范围比Bradford法的更宽，不需长的孵化期，试剂常温下贮存。在添加IDCR试剂（专有离子去垢剂的相容性试剂）在浓度为50mM该方法不受常用的清洁剂和还原剂的影响，包括样品含有溴酚蓝的Laemmli样品缓冲液。BCA（二喹啉甲酸）蛋白比色法通常用来测较稀的同时存在280nm有较强吸光强度的其它成分的蛋白质溶液。由此产生的蛋白-染料螯合物在其最大波长562nm下测其吸光度，并在750nm做标准化。Bradford法是根据蛋白能够使考马斯亮蓝改变吸收位移至595nm来检测蛋白浓度的。可以从多个厂家购买稳定的混合物考马斯亮蓝染料，其中包含了考马斯染料，乙醇和表面活性剂套件形式。响应值随蛋白质的组成不同而有变化。该法还对非蛋白来源，特别是清洁剂有响应，并且在高浓度时出现非线性。改性Lowry蛋白分析法是蛋白质与硫酸铜在碱性环境下反应形成铜-蛋白螯合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生水溶性深蓝物，在一定的范围内，蓝色深度与蛋白的量成正比。在650nm下检测，405nm处做标准化。试验中使用的试剂可以从多个厂家购买。吸光度测试方法NanoDrop?2000/2000c操作系统软件A280模式用于检测纯蛋白质样品的浓度。朗伯比尔定律用浓度来(A = E * b * c )用来关联的吸光度与浓度纯：A是吸光度值（A），E是与波长相关的摩尔吸光系数（或消光系数），单位为L/ mol-cm）；b是光程长，以厘米计，c是分析物浓度，用摩尔/升或摩尔浓度（M）来表示。该软件提供了六个选项，选择合适的消光系数，与朗伯比尔定律结合在一起，用于计算样品浓度：一般的理论基础是：0.1％（1 mg/ml）的蛋白质溶液在280 nm产生1.0的吸光度(当光程是1cm).以牛血清蛋白为参考：未知蛋白样品浓度计算用质量消光系数6.7在280nm