药学分子生物学（唐晓波）第三节 原核细胞表-新.pptVIP

复习;*目的基因的获得;*载体;*克隆载体 (cloning vector);*表达型载体;*重组;*DNA连接酶的分类;*感受态细胞(competent cell) 用特殊方法（CaCL2）处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞。 ;重组子导入宿主细胞;转导(transduction) 由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。;转染 (transfection): 真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。;第三节原核细胞表达系统;;一、*表达载体;（2）外源目的基因的转录系统;(β-半乳糖苷酶);启动子;大肠杆菌基因表达载体;启动子;P tac = 3 P trp = 11 P lac;IPTG诱导启动子--Lac;Lac转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子CAP 负调节因子lac I ;Lac表达系统 正调节因子CAP：cAMP激活CAP，CAP–cAMP复合物与lac操纵子上专一位点结合后，能促进RNA聚合酶与–35、–10序列的结合，进而促进 Plac介导的转录。;;负调节因子lac I 在无诱导物情形下， lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。 ;;IAA诱导启动子--Trp;Trp转录调控机理;Trp 表达系统;杂合启动子--Tac;;温度诱导启动子--PL和PR;因此PL、PR表达系统都选用温度敏感突变体cI 857(ts) 的基因产物来调控PL、PR启动子的转录。 在较低温度（30℃）时以活性形式存在。 在较高温度（42℃）时失活脱落。;PL和PR表达系统;PL和PR表达系统; 由于PL和PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL 或PR 表达系统。 ;PL和PR表达系统存在的问题;最常用启动子--T7;T7表达系统;T7表达系统;T7表达系统;T7 RNA 聚合酶; T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体DE3是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有lacI、lacUV5启 动子和 T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段被插入其int基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。; T7 表达系统 转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制T7 RNA聚合 酶基因，通过热诱导方式激发 T7噬菌体启动子的转录。 这种方式可以使本底转录降到 很低的水平，尤其适用于表达 对大肠杆菌宿主有毒性的重组 蛋白质。 ; T7 表达系统 转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA聚合酶 基因，另一个质粒带有T7启 动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记 不能相同 调控方式为控制T7 RNA聚合 酶的启动子调控类型;终止子;终止子;终止子;终止子;（3）蛋白质的翻译系统;核糖体结合位点;二、表达菌株;原核细胞表达菌株;大肠杆菌基因工程菌的构建策略;*包涵体及其性质;*包涵体表达形式的优点;包涵体表达形式的缺点;经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白，尤其当目标蛋白分子中的半胱氨酸残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。;包涵体的变性与复性操作;包涵体的变性与复性操作;包涵体的变性与复性操作;包涵体的变性与复性操作;*目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达;目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达;目标蛋白外泌表达;目标蛋白外泌表达;小结;;一、*表达载体;包涵体;*包涵体表达形式的优点;*可溶性蛋白质的分离纯化;常用的与目标基因融合表达的序列;复习;;一、*表达载体;包涵体;*包涵体表达形式的优点;可溶性蛋白质的分离