神经节苷脂GM,3对人单核样白血病J6-2细胞磷脂酶C,γ1转位和生长因子受体磷酸化的影响.pdfVIP

神经节苷脂GMa对人单核样白血病J6—2细胞 磷脂酶研1转位和生长因子受体磷酸化的影响 硕士研究生：毕晓郁 指导教师：马克里 教授 专业名称：生物化学与分子生物学 摘 要 神经节苷脂GM。作为一种促分化剂已在多个细胞瘤株模型中得到 证实，但迄今为止其促分化的详细机制仍未阐明。本课题前期研究工 作发现，神经节苷脂G地诱导人单核样白血病J6-2细胞沿单核／巨噬细 胞途径分化的同时，可抑制J6—2细胞磷脂酰肌醇(PI)特异的磷脂酶 C(PI—PLC)，使细胞二脂酰甘油(DAG)水平降低，从而抑制蛋白激酶c (PKC)由胞液向质膜的转位及活化。 PI—PLC的作用是水解磷脂酰肌醇4，5一二磷酸(PIP：)生成两个细 胞内重要的第二信使DAG和l，4，5一三磷酸肌醇(IP3)。迄今已发现 中分布不同，其活化机制也不同。已知PLcD家族成员由G蛋白偶联受 体激活，PLC7，和PLC7：由生长因子受体激活。因此，要弄清G地抑制J6—2 细胞PLC的机制，首先要确认G地所影响的PLC的类型。本文着重观察 G地对J6—2细胞PL研的影响，从而对G地抑制PLC活性机制进行探讨。 目前尚无测定细胞内单一类型PLC活性的特异性方法，但已知PLCy 活化的两个必要条件是磷酸化和由胞浆向质膜转位。本文采用洋地黄 皂甙(Digitonin)增加细胞膜渗透性，释放胞液蛋白，通过离心将细 胞蛋白分为胞液蛋白和颗粒结合蛋白两部分，然后采用SDS， Western blot及酶联免疫显色技术，并结合计算机扫描半定量技术， ·1’ 检测了GMa处理前后PLcYl在细胞内的转位情况。结果发现：G地处理 组J6—2细胞胞液部分PLC71与对照组相比显著增加，而颗粒结合部分 PLC丫l则相对减少。这一结果说明，GM,抑制了PLC71由胞浆向质膜的 转位，提示GM3抑制PLC亚型可能是PLCvl。 PLC在质膜上的定位是发挥其催化作用的必要条件，已知PLCTl含 有PH结构，可借助于PH结构与质膜上的PIP3识别结合，并借以定位 于质膜。因此，质膜PIP3的含量是影响PLClr在质膜定位的重要分子。 本文采用无载体”P标记细胞质膜磷脂后，用有机溶剂提取，高效薄层 层析，放射自显影结合计算机扫描半定量技术，观察了G地对J6—2细 胞PIP3含量的影响。发现GM3处理组细胞PIP3含量明显减少，仅为对 照组的10％左右，这一结果说明G地显著抑制P13K活性，从而使PIP3 产生减少。这可能是GM，抑制PL研1向质膜转位的重要原因之一。 PL研主要由活化的生长因子受体激活。生长因子与受体(受体型 酪氨酸蛋白激酶)结合使受体二聚体化并自身磷酸化被活化，活化的 受体胞内区域形成磷酸化酪氨酸位点。PLc丫可借自身的SH2结构与受 体磷酸化位点结合，然后在受体激酶催化下磷酸化被激活i本文进一 等)磷酸化的影响。结果表明，GM3显著抑制EGFR的磷酸化，对其它 生长因子受体磷酸化无显著影响。 综上结果，作者推测G磁抑制J6—2细胞PLC活性至少可能通过两 条途径。其一方面可以通过抑制PIP3的生成来抑制PLC，l,I的转位，另 一方面也可通过抑制EGFR胞内部分酪氨酸磷酸化水平抑制PL研1的活 Q活性受到抑制。 化。其结果使DAG水平降低，PKC EGFRINRPIP3 关键词： 神经节苷腊GM3磷脂酶c丫 ·2· Effects of the on translocationof Ganglioside GM3 Phospholipase andthe ofGrowth 研l Factor