1抗原提取.pptVIP

可溶性抗原的制备与纯化 细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀或层析等方法进一步纯化。 而体液中(如血清等)的可溶性抗原则可直接用生化手段获得所需成分。 1、处理与粉碎 2、蛋白质分离 3、单一组分提取 4、抗原纯度鉴定 2、化学 （1）溶菌酶处理法：用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。 如加溶菌酶，37℃，保温10min ，还有蜗牛酶、纤维素酶 （2）表面活性剂处理：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。 盐析：蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。 *应用最广的是硫酸铵 *分段盐析 H抗原\ O抗原 抗原分离有哪些方法 偶联剂的有碳化二亚胺类、戊二醛、氯甲酸异丁酯法、琥珀酸酐法O-（羟甲基）羟胺法、一氯醋酸钠法、重氮化的对氨基苯甲酸法等 * 抗原制备的目的 免疫原：激活T、B细胞 半抗原：检测相应抗体 抗原制备的主要技术途径 天然抗原——分离、纯化 完整的细胞(包括细菌抗原等) 细胞内分子 半抗原——人工合成、载体联接 农药、兽药 、激素 抗原肽—— 合成、基因工程制备 完全抗原/免疫原的制备方法 一、颗粒性抗原的制备 细胞性抗原 二、可溶性抗原的制备 细胞内分子 颗粒性抗原的制备 1、采集、分离抗原（制备简便） 新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液稀释。 细菌抗原，新鲜培养物经集菌处理， 2、无害化处理 H抗原因不耐热用0.3％～0.5％甲醛处理， O抗原耐热可加热100℃2h去除H抗原后应用。 H抗原（细菌的鞭毛具有抗原性，称为鞭毛抗原，不同细菌的H抗原具有特异性，常作为血清学鉴定的依据之一。） O抗原(菌体抗原) 处理与粉碎 机械、化学 目的：必须把组织和细胞粉碎，使活性物质释放到溶液内 1、机械 捣碎 、匀浆 、超声波处理 反复冻融法：样品冷却到零下15～20度冻固后取出解冻， 如此反复操作。 冷热交替法：把材料投入90度左右水中维持数分钟后取出 投入冰浴内。 高速组织捣碎机 玻璃匀浆器 超声波破碎仪 分离方法： 盐析——透析 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀 （蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异 而分离的方法 ） 粗提后抗原的浓缩 ： 蒸发法、冷冻法 超滤技术： 蛋白质分离（粗提） 真空离心浓缩仪 冻干机 超滤装置 提取 层析技术：凝胶过滤 离子交换 亲和层析 离心技术：差速离心 密度梯度离心 电泳技术： SDS第三节 半抗原免疫原制备的方法 一、载体的选择 二、半抗原与载体的联接 载体的选择 蛋白质载体：人血清白蛋白（HSA）、 牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）、 牛甲状腺球蛋白（TG） 聚合多肽载体：多聚赖氨酸、多聚谷氨酸 高分子聚合物载体：羧甲基纤维素、乳胶和炭末等 半抗原与载体的联接 1、连接方式：物理法（吸附） 化学法 2、化学连接方法： 直接联接法： 间接联接法： 半抗原与载体直接联接 碳化二亚胺法 蛋白质-COO— + R-N+=CN-R` H-N+-R 蛋白质-COO-C-NH-R` + 半抗原-NH2 O 蛋白质-C-NH-半抗原 + R-NH-CO-NH R` 半抗原与载体直接联接 戊二醛法 蛋白质- NH2 + 半抗原-NH2 + COH-（CH2 ） 3 - COH 蛋白质-N=CH-（CH2 ） 3 – CH=N-半抗原 半抗原与载体直接联接 氯甲酸异丁酯法 半抗原-COOH + Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 O O 半抗原-C-O-C-O-CH2CH（CH3）2 + 蛋白质- NH2 半抗原-CO- NH -蛋白质 + HO-CH2CH（CH3）2