GCLM基因及迟发性运动障碍关联性分析.doc

GCLM基因及迟发性运动障碍关联性分析摘要:采用PCR-RPLC法对样本基因组进行扩增与酶切,用UNPASED3.0对GCLM基因位点基因型和等位基因进行卡方检验,结果显示GCLM基因位点的等位基因和基因型均与迟发性运动障碍的病症无明显相关性。 关键词:GCLM基因;迟发性运动障碍;等位基因频率 中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0052-2 迟发性运动障碍(tardive dyskinesia,TD)是精神科临床较为常见的一种由抗精神病药物所诱发的运动系统副作用,这种药物副反应虽不是致命的,但是具有明显的致残性,发生率高,而且随患者年龄的增大而增加。目前尚未找到有效的治疗手段,因此对迟发性运动障碍方面的进一步研究日益迫切。 GSH是体内重要保护因子,在保护生物膜及生物大分子免受自由基损伤方面起着重要作用。GSH―PX是催化过氧化氢分解的重要酶,能特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应,起到保护细胞膜结构和功能完整性的作用。谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶,后者在调节细胞氧化还原状态、避免氧化损伤过程中发挥主要作用。GCL由催化亚基(GCL catalytic subunit,GCLC)和修饰亚基(GCL modifier subunit,GCLM)组成,前者具有全部催化活性,而后者具有重要调节功能。 1 实验材料与方法 1.1实验样本 1.1.1 样本来源 TD病人血液样本采自北京回龙观医院的患有迟发性运动障碍的病人,共226例;正常对照血样均来自医院体检正常健康人,共192人。以上研究对象均为中国汉族人。 1.1.2 样本处理 对所有血样抗凝管进行离心,4000r/min,分离出血浆,红细胞,剩余血样提取DNA,均置于-20℃保存待用。 1.2 主要仪器与试剂 PCR仪(山特电子深圳有限公司)电子天平(郑州南北仪器设备有限公司)电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)离心机(美国Sigma公司)ND-1000紫外分光光度计(美国Gene company limited 公司)凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)漩涡震荡仪(北京北方同正生物技术发展公司)电泳仪(北京六一仪器厂)水平琼脂糖电泳槽(北京六一仪器厂)琼脂糖(美国Promega公司)Primers(北京奥科生物)Taq DNA聚合酶(美国Promega公司)限制性内切酶Eco81 I(美国Promega公司)溴化乙锭(大连宝生物工程有限公司),溴酚蓝(大连宝生物工程有限公司)DNA标准Marker(大连宝生物工程有限公司) 1.3 实验方法 1.3.1 引物设计 应用Primer3(http://www.sagb.co.uk),结合PCR引物设计原则,来设计PCR扩增的引物。本实验所用引物见表1。 表1 中国籍样本PCR所用引物序列 Gene SNP primer sequence GCLM rs718875 F: 5-GAAGGAGCAGAACCAACT-3 R: 5-AGAGAGCGGAGAACAAAC-3 1.3.2 PCR反应循环条件与酶切体系 PCR反应循环条件:(1)95℃,5min;(2)95℃,30s→59℃,30s→72℃,30s 循环30-35次;(3)72℃,5min;(4)4℃保存。 酶切反应体系为: DNA(扩增产物) 10μL 限制性内切酶(10U/μL) 0.3μL 1×Buffer 0.3μL DdH2O 2.4μL SNP所需限制性内切酶及其反应条件;PCR产物酶切后片段长度及其基因型见表2。 表2 各基因型和限制性内切酶信息 Gene RE Fragent length Cut Homo Cut heter Utcut Homo T(℃) GCLM Eco81 I 110/290/400 CC CT TT 37 2 实验结果 2.1 基因型与等位基因频率 对所有样本的GCLM基因型进行PCR鉴定,该位点也是一个C/T二态SNP,扩增后长度为400bp,酶切后产生110bp和290bp两条片段,在群体中组成C/C、C/T和T/T三种基因型。用UNPHASED3.0计算出病人组与正常组基因型与等位基因频率,括号内数值为各基因类型所占百分比。结果见表3和图1。 表3 GCLM基因的基因型和等位基因频率 Group Genotopic numbers(%) Allelic numbers(%) C/C C