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第八章 亲和色谱 ( Affinity chromatography) 1 第一节生物亲和作用 一、生物亲和作用的概念 • 生物分子能够区分结构和性质非常相近的其 他分子，选择性地与其中某一种分子相结 合——生物分子间的这种特异性相互作用称 生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称 生物亲和作用 为特异性结合或亲和结合。 二、亲和作用的本质 • 亲和作用是分子之间的结合作用，自然界普遍存在 的现象，生物分子间的亲和作用具有更高的选择性 必要条件：钥匙和锁孔的关系 此外，还需要具备相互作用： 静电作用；氢键；疏水性相互作用；配位键； 弱共价键 三、影响亲和作用的因素 • (1) 离子强度 静电引力 提高离子强度 减弱或完全破 氢键 坏亲和作用 提高离子强度 疏水相互作用 亲和作用增大 静电引力在亲和作用中占重要地位，所以一般可以 用高盐洗脱 • (2) pH值 • 蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基 团，不同解离基团的解离常数不同。 羧基 pH不同，带电性不同 如果，静电引力对亲和作用的贡献最大，pH就会 严重影响亲和作用。溶液pH值选择非常重要。 • (3) 抑制氢键形成的物质 • 脲、盐酸胍 减弱亲和作用 • 蛋白质的强烈变性剂 • (4) 温度 温度↑分子和原子的热运动加剧，静电作用 、氢键及金属配位键减弱，但疏水性增加。 • (5) 离液离子 半径较大的离液阴离子降低疏水相互作用 • (6) 螯合剂 如果亲和结合作用源于亲和分子对于金属离子形 成的配位键，则加入EDTA等螯合剂会使亲和结 合作用消失。 四、亲和作用体系 第二节亲和色谱原理 • 将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固定 粒子共价偶联，可以特异性吸附或结合另一种分 子，使另一种分子容易从混合物中得到选择性分 离纯化。 • 亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合 对象的配基，亲和色谱的固定相是键合亲和配基 的亲和吸附介质。 • 操作一般分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱和 色谱柱再生等4个步骤。 第三节亲和色谱介质 • 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基。配 基必须偶联于不溶性母体上。母体又称为载体或 担体，一般采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙 烯酰胺凝胶和纤维素等。 • 当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作 用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与 配基之间引入适当长度的间隔臂，以增大配基与 载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的 亲和结合。 亲和配基 • ① 酶的抑制剂 与酶的活性部位结合 • 生物大分子或小分子化合物 • ② 抗体 单抗和多克隆抗体 免疫亲和色谱 • ③ A蛋白 相对分子量约42000,与抗体结合,但不影 响抗体与抗原结合 可用于分离抗体-抗原复合体 • ④ 凝集素 与糖特异结合的蛋白质的总称,如刀豆 蛋白可用作糖蛋白、多糖、糖脂等的亲和配基。 • ⑤ 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶的亲和配基 • ⑥ 色素配基 脱氢酶、激酶、血清白蛋白、 干扰素、核酸酶、溶菌酶和糖解酶等 • ⑦ 过渡金属离子 • Cu 2+ ，Ni 2+ ，Zn 2+和Co 2+等可与组氨酸的咪 唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基亲和 结合。与咪唑基的结合顺序是Cu 2+ ＞Ni 2+ ＞ Zn 2+ ＞Co 2+ • ⑧组氨酸 • 较低盐浓度