第1页 zjnsf 浙江省自然科学基金资助项目研究工作总结（2013年度 .doc

1、研究工作总结 目 录 一、研究内容………………………………………………………………………………… 二、研究方法………………………………………………………………………………… 三、研究成果………………………………………………………………………………… 四、研究结果的意义……………………………………………………………………… 五、…………………………16 六、实际完成课题的研究人员及作用…………………………………………………… 七、建议与展望…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………16 茶黄素为红茶中多酚类化合物，最初是由Roberts等人从红茶提取物中分离鉴定，因呈橙黄色而得名。茶(Camellia sinensis (L.), O. Kuntze) 鲜叶本身不含茶黄素，但鲜叶在红茶加工过程中经过萎调处理和揉捻或剪切后，叶细胞的破碎促使叶内的儿茶素被酶促转化而成 (如下图所示) 。 茶鲜叶中表没食子型儿茶素(EGC(EGCG) 的含量是表型儿茶素(EC(ECG)的3~4倍(摩尔数)，酶促生成的4种茶黄素(图1)总量在红茶中应有6 %～8 %(w/w)，但传统加工工艺制造的红茶中4种茶黄素单体总质量份数低于2 % (w/w)，茶儿茶素体外酶促合成茶黄素的机理对于红茶实际生产品质控制可以起到指导作用另一方面，茶黄素不仅是红茶的品质特征因子，而且具有降胆固醇、抗肿瘤、抗氧化，等功效特别是茶鲜叶中的儿茶素及酶促合成的茶黄素具有丰富的酚羟基，可以清除活性氧如单线态氧、超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基，从而可以有效阻断促氧化致癌剂对细胞内遗传物质DNA的破坏作用。茶儿茶素及茶黄素不仅直接清除活性氧，其对体内氧化还原酶体系的作用亦能起到间接作用，阐述其内在的分子机制对于指导人们科学饮茶具有十分重要的现实意义。 一、研究内容 1.1 儿茶素单体茶鲜叶粗酶液酶促氧化规律； 1.2 配对儿茶素茶鲜叶粗酶液酶促生成与降解茶黄素规律； 1.3 配对儿茶素氧化顺序对茶鲜叶粗酶液酶促生成茶黄素的影响； 1.4 外源性化合物对茶鲜叶粗酶液儿茶素酶促生成茶黄素的影响； 1.5 儿茶素及茶黄素体外清除羟自由基的能力强弱变化规律； 1.6 儿茶素及其金属离子络合物影响胞内活性氧水平机制。 二、研究方法 2.1 酶活力测定方法 0.5 mL的粗酶液，pH5.6的磷酸缓冲液(100mM) 1 mL，0.1 % 的辅氨酸0.2 mL，一定浓度底物的0.2 mL混合后37 ℃反应10 min后加入1.5 mL的偏磷酸(1)终止反应于460 nm处测定溶液吸光值。 2.2 粗酶液的制备及酶促反应条件 将3 g冷冻(-30℃)的茶鲜叶置匀浆机中，加入5 g PVPP和预冷的磷酸盐缓冲溶液(pH5.6, 100 mM) 80 mL，匀浆5分钟后，用8层纱布过滤，置于4 ℃高速离心机(Sigma3K15，转子11133，转速5500转/分钟)离心50分钟后，将上清液置于冰箱中(-30℃)备用。 实验用茶鲜叶(金萱品种，2011年04月中旬)、匀浆机及sigma离心机 0.4 mL粗酶液于10 mL刻度试管中，迅速加入一定体积儿茶素标准溶液(环境温度25 ℃)并用上述缓冲溶液定至1.5 mL，于37℃水浴中反应至一定时间再迅速(1 min.内)取800 μL酶促反应液置1 mL进样瓶中自动进样分析。 2.3 儿茶素与茶黄素含量测定 儿茶素与茶黄素采用美国Waters高效液相色谱仪(1525泵配备2487双通道紫外-可见检测器，柱温箱及717-Plus自动进样器，Breeze控制软件)进行定量分析(检测波长270 nm，进样体积10 μL)。色谱柱(Waters symmetryTM, Hypersil-C18, 150 mm(i.d.4.6 mm；柱温：25 ℃)洗脱条件参照已有方法[15]并作一定的修改：初始相100 %的流动相A(含有体积份数5 %乙酸乙酯和2 %醋酸的水)及0 %的流动相B (HPLC级乙腈，美国TEDIA公司)维持2分钟后，经过2分钟梯度变至75 % A 和 25 % B，维持10分钟，再1分钟内回到初始相，维持10分钟后(如图所示)，进行下一针分析。据上述方法所建立的儿茶素及茶黄素标准曲线(5~40 mg/L)分别为：YEGC=2896.7(CEGC + 2641.3，R2=0.9985；YEC=7183.9(CEC ( 2317.1，R2=0.9995；YEGCG=18333(CEGCG ( 5935.3，R2=0.9996；YECG=22591(CECG ( 8854，R2=0.9999；YTF=13621(CTF ( 5332.5，R2=0.999