牛分枝杆菌fixb、hspx和mpb83 基因的原核表达及鉴定.pdf

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　２０１７（０６上）：１５－１９ 牛分枝杆菌 ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和 ＭＰＢ８３ 基因的原核表达及鉴定 １，２ ２，３ １ １，２ ２ 陈　爽 ，许　芳 ，张林波 ，张喜悦 ，范伟兴 （１．吉林农业大学 生命科学学院，长春 １３０１１８；２．中国动物卫生与流行病学中心， 山东 青岛２６６０３２；３．甘肃农业大学 动物医学院，兰州７３００７０） ＋ 中图分类号：Ｓ８５２．６１８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－７０３４（２０１７）０６－００１５－０５ 关键词：牛分枝杆菌；ＦｉｘＢ；ＨｓｐＸ；ＭＰＢ８３；原核表达；纯化 摘　要：为了给原核表达牛分枝杆菌ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３基因并纯化ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３蛋白，进 一步研究它们在牛结核病诊断中作为特异性抗原的诊断价值及应用奠定基础，试验用ＰＣＲ方法从牛 结核分枝杆菌ＡＦ２１２２／９７基因组中扩增出ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和 ＭＰＢ８３基因片段，构建ｐＥＴ－２８ａ－ＦｉｘＢ、 ｐＥＴ－２８ａ－ＨｓｐＸ和ｐＥＴ－２８ａ－ＭＰＢ８３重组质粒，克隆到ＤＨ５ɑ感受态细胞，提取测序正确的阳性重 组质粒，转化ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞，用１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ于３７℃诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析目的蛋 白的表达形式，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析鉴定并用Ｎｉ－ＮＴＡ层析柱纯化蛋白。结果表明：成功扩增了大小 依次约为９５７ｂｐ、４３５ｂｐ和６６３ｂｐ的ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３基因，将其连接ｐＥＴ－２８ａ原核表达载体， 原核表达的ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３重组蛋白均以包涵体形式存在，分子质量依次约为３７ｋｕ、２１ｋｕ和 ２８ｋｕ。经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定表达产物为ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３重组蛋白，Ｎｉ－ＮＴＡ成功洗脱出目的 蛋白。说明试验成功构建了牛分枝杆菌ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３基因的原核表达载体，并纯化了ＦｉｘＢ、 ＨｓｐＸ和ＭＰＢ８３重组蛋白，可用于进一步的应用研究。 ［４］ 　　牛结核病（ｂｏｖｉｎｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，ＴＢ）主要是由牛分 Ｍ．Ｌ．Ｍｏｎ等 通过液相色谱 －质谱联用技术 枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ，Ｍ．ｂｏｖｉｓ）感染引起的一 （ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析发现 ＰＰＤ成分中的７个有效抗 种慢性传染病。牛分枝杆菌的主要感染宿主是牛，但 原：ＣＦＰ１０、ＣＦＰ２、ＭＰＢ７０、ＭＰＢ８３、ＦｉｘＢ、ＰｅｐＡ、ＨｓｐＸ。 其也感染许多其他哺乳动物包括人类［１］。目前，牛 本研究选择ＦｉｘＢ、ＨｓｐＸ、ＭＰＢ８３三个蛋白进行表达纯 结核病诊断的主要方法是结核菌素（ＰＰＤ）皮内试验。 化。ＦｉｘＢ是一个电子转移黄素蛋白，参与肉碱还原 ＰＰＤ是多种蛋白、脂类和糖的混合物，含有其他分枝 反应，在电子传递中起关键作用，但在结核分枝杆菌 杆菌的交叉抗原，容易产生假阳性反应，特异性 中的功能尚不明确［５－７］。调节蛋白ＨｓｐＸ，在结核杆 ［２］ ［３］ 差 。Ｓ．Ｂｏｒｓｕｋ等 发现ＰＰＤ中大部分蛋白质是胞 菌潜伏感染期间是机体免疫反应重要的靶抗原，是结 质蛋 白（７７．９％），参与 中间代谢和呼吸作用 ［８］ 核分枝杆菌在巨噬细胞内存活所必需的 。ＭＰＢ８３ （２４．２５％），禽型ＰＰＤ中大部分蛋白质参与脂代谢。 在牛分枝杆菌中高水平表达。有研究证明，结核分枝 杆菌ＭＰＢ８３抗原接种疫苗能够诱导体液免疫应答和