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遗传 学报，26(5):512--517,1999 Acta GeneticaSinica 水稻条叶枯病毒基因产物在水稻和昆虫 体内的Western印迹分析 曲志才‘沈大棱①，徐亚南‘谈家祯 ‘RogerHULL (1复旦大学遗传学研究所 上海 200433) (2Dept.ofVirusResearch,JohnInnesCentre,NorwichUK) 摘要 将RStV基因组组分3编码的NS3和NC蛋白基因以及组分4编码的）vcp和NSvc4蛋 白基因分别克隆于大肠杆菌表达载体pGEX3X，在IPTG诱导下，表达出4种融合蛋白。这些 表达产物用于免疫动物产生多克隆抗血清。以制备的多克隆抗血清为探针，Western印迹分析 了宿主植物和介体昆虫体内NS3,NC,NCP和NSvc4种基因表达的产物。NC蛋白的抗体可在 病株和病毒粒子制备物中以及NCP抗血清仅在病株中检测到相应大小的产物，其余的均与预 期值相悖。 关键词 病毒基因，基因表达，融合蛋白，印迹分析 分类号 Q753 水稻条叶枯病是水稻上的重要病毒病害，在流行年份会造成水稻严重减产。引起该病的 水稻条叶枯病毒 R（StV)，为一类具有双义(ambisense）编码特性的多组分RNA病毒。它通过 灰稻虱(mode加haxstriatellus）以持久方式传播[3l［，并能在介体昆虫内及感病的植物体中增殖， 经卵传递给下一代介体2[1［。目前，我国云南分离物Y基因组组分3和4的全序列已被报道， 其编码特性、基因组成等方面与日本RStv的研究结果一致[3]［0 该病毒基因组组分4的vORF(viralsenseORF）编码的NCP已从感病植株纯化出来， 用于ELISA检测2[1［。至于NS3,NC和NSvc4的免疫检测，迄今仍未见报道。本研究利用大 肠杆菌表达的病毒基因产物制备多克隆抗血清，通过Western印迹检测了水稻病株和带毒 虫体内NS3,NC,NCP及NSvc4蛋白产物的存在。 I 材料 供试RStV毒源材料采 自云南省楚雄地区感病稻田。大肠杆菌DH5“为受体菌；质粒 pGEX3X和羊抗GST谷（胧昔肤S一转移酶）抗体购自Pharmacia公司。病毒基因克隆及 PCR扩增用试剂为BoehringerMannheim和Gibco1BRL公司产品。碱性磷酸酶偶联的羊 抗兔IgG及其底物BCIPINBT为Sigma公司产品。蛋白质印迹用硝酸纤维膜 H（ybond C）为Amersham公司产品。 本文于1998-03-04收到，1998-08-31修回 本研究受美国McKnight*金和上海市科委自然科学基金资助 ① 联系人 5期 曲志才等：水稻条叶枯病毒基因产物在水稻和昆虫体内的Westem印迹分析 513 2 方法 2.1病毒的提取与纯化、cDNA合成、克隆及序列分析按文献 3【]进行。 2.2 病毒基因在大肠杆菌中的表达 根据所测序列设计专一性寡核昔酸引物作PCR 扩增 表（I)，反应条件为：940CImin,50}CImin,72-CImin,30个循环。电泳鉴定后的扩增 产物与载体连接，电击法转化大肠杆菌DH5a，于含X-Ga】和IPTG的竣节平板上挑选白色 克隆，经限制酶酶切和多克隆位点区两端的测序鉴定，得到阳性重组子。融合蛋白的诱导 表达及表达产物的制备按文献 4［]进行。 表I用于PCR扩增的寡核昔酸引物 Table1 OligonucleotideprimersusedtogeneratePCRproducts ORF 引物名称 引物组成 位置 产物 b（p) Primername Primers Position Products V3529 5gcgcggatccACGTGTTCACATCGTCTGTGGG3 70 .91 NS3 BamM