氨基转换作用2009.ppt

实验五 氨基转换作用 目的要求：了解转氨酶在代谢过程中的重要作用 学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应 实验原理 体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基转换作用。 转氨酶 (aminotransferase) 　 转换酶中的一类。催化氨基酸和a-酮酸 或醛酸之间的氨基转换反应，生成与原来的a-酮酸或醛酸相应的a-氨基酸或ω- 氨基酸，原来氨基酸转变成相应的酮酸。转氨酶催化的反应都是可逆的 转氨酶参与氨基酸的分解和合成，是人体代谢过程中必不可少的“催化剂”； 以谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）最为重要。 GPT 主要存在于肝脏、心脏和骨骼肌中，在肝脏中活力最大。GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。  本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸－丙酮酸氨基转换酶（简称谷－丙转氨酶）的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。 操作方法 一、转氨酶作用 1、取试管2只编号（1、2），向每个试管各加0.5mL 1%谷氨酸溶液,0.5mL 1%丙酮酸溶液,0.5mL 0.1% KHCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸, 混匀。然后分别加入肌肉糜提取液0.5ml，混匀，将其中一试管立即在沸水浴中加热2-3分钟做对照。用试管帽塞住另一只试管 置于45℃水浴中保温40 min。 2. 保温完毕，取出试管。向每只试管中各加2% HAc溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白质完全沉淀。过滤收集滤液或取1毫升在EP管中高速离心1分钟 二、层析验证 1. 取小培养皿一个，加入酚饱和水溶液约0.5cm高，取圆形滤纸一张，在中心剪一直径1-2mm的小孔，并以圆心约1cm为半径划一圆作为底线。在此底线上，用铅笔点四个等距离的原点并表明1，2，3，4。 2.点样 用毛细管分别吸取以上两种滤液及标准谷氨酸、标准丙氨酸，依次点在标明号码的原点处，以吹风机吹干，再重新点样2次。注意斑点不能太大，一般直径约2mm为宜。 3.另取一条滤纸卷成实心筒状，直径约2mm,将此小筒插入滤纸中心小孔（不可突出纸面之上），使层析滤纸通过此小筒与酚溶液相连。然后将滤纸平放在盛饱和酚的培养皿上。另取一培养皿盖在滤纸上，此时酚溶液即由滤纸中心孔向四周扩散。 4. 当酚溶液扩展到直径约7-8cm时，取出滤纸。用铅笔画下酚溶液扩展边缘，用吹风机吹干。用喷雾器喷以0.1%茚三酮溶液，再用热风吹干。用铅笔圈下各显色点。测定各显色点的Rf 值，并解释之。 注意: 当温度、滤纸质量和展开剂等都相同时，对于一个化合物比移值Rf是一个特有的常数 。 重 要 通 知 第十周的蛋白质分离纯化大实验安排在周末进行，第九周周末开始。实验时间08：30~17：00，中午可以轮换去吃午餐。实验具体日期及班级安排如下： 11月14日 周二晚上做实验的所有同学。104人 11月15日 周四晚上做实验的所有同学。100人 11月21日 周五下午做实验的所有同学。98人 11月22日 周一下午B类（2）实验的所有同学。88人 备注：1.如最后一次实验的同学，本次实验报告隔一周后由班长 代收，集中送到生物楼4—316室。 2.B类（2）实验同学的课程，第11周恢复正常上课时间，即11月23日进行质粒DNA的抽提实验（实验52）。 * * 谷丙转氨酶 L－谷氨酸 丙酮酸 α-酮戊二酸 L－丙氨酸 由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基转换过程的观察，因此在反应体系中添加溴乙酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。 试剂和器材 试剂 1%谷氨酸（中性）；1%丙酮酸钠（中性）；0.1%KHCO3；0.025％ 溴醋酸（中性）；2% 醋酸；0.1%标准谷氨酸；0.1%标准丙氨酸。 展开剂：酚饱和水溶液：2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振荡。静置24hr后分层，取下层酚置瓶中备用；通风橱里 显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。 材料 肌肉糜：取兔子肌肉1g，置研钵中，加0.9% 氯化钠溶液3ml，在低温下研磨成细浆，离心5分钟（3000转/分），弃去沉淀，得肌肉糜提取液。 1 2 3 4 三、计算公式 Rf＝原点至斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离 1. 什么叫转氨作用？ 2. 根据所学理论阐明转氨作用在蛋白质的合成与分解及糖、脂肪代谢中有何作用？ 思考题