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显微摄影技术 一、普通光学显微摄影 拍摄前准备： 显微摄影室应保持清洁、干燥、安装窗帘，避免强光直接照射，显微镜台要稳固防震。 根据拍摄目的选择感光片、滤色镜。黑白摄影注意调节反差，彩色摄影注意彩色平衡。 检查标本片是否洁净，必要时进行认真擦拭。 ▲有关调节： 光轴对正（中心调节、合轴调节），光轴的对正是使聚光器、物镜、目镜和光源的中心处在同一直线上。如果它们之间不同轴，则像差增大，分辨力下降，成像质量差，调节合轴操作步骤如下： 先调节可变光阑，方法是：将光阑关小然后将它的中心小孔调节到正好和聚光器下方透镜中心一致。 使显微镜正对光源。把聚光器上升到它上端平面稍低于载物台平面的高度，将它的可变光阑开到最大。 把低倍物镜转到工作位置上，安上一个低倍目镜。 在载物台上放一片标本片，然后调焦使能看清标本。调反光镜或灯泡位置，使视场照明均匀，最亮光束正处中央。 转换高倍（40倍左右）物镜再进行一次调焦然后去掉标本。 去掉目镜，眼睛直接向简内观察，将聚光器下的光阑慢慢地缩小和打开数次，注意光阑缩小到最小时亮点是否处在视场的中心，如果不是，就要用聚光器螺旋杆调节，进行对正，对正的标准一是：光阑缩到最小时，亮点处在视场中心，这表示已合轴；二是开启光阑口径到视场等大时，光阑光孔所显示的圆圈与视场圆圈同心程度良好，然后重新安上目镜，合轴调节完毕。 聚光器的调节 柯勒照明法：在一定位置上的光源通过焦光镜到达场光阑（也叫光源光阑），聚光器接收了来自场光阑的光线，并通过上下移动使场光阑的图像在标本平面上聚焦。如能在视场中看清场光阑开口的边缘，收启光阑又可见到视场中照明面积随之改变，说明已达到柯勒照明要求。新式内装照明显微镜，不需要调节灯的位置，主要是通过调节聚光器高度达到柯勒照明的要示。 聚光器的高度： 聚光器的聚焦点在标本的平面上，其效果最好。但是如在使用低倍物镜时，由于受到某些光源条件的限制，常常出现照明面积太小的情况，这时只能将聚光器的位置下降，以增大照明面积，这时聚光焦点下降，物镜镜口角缩小，因面损失掉一部分分辨力。因此聚光器的高低有时也要考虑光线均匀、强度等因素。聚光器升高视场明亮，反之视场变暗。 聚光器与物镜的配合： 所谓配合是指聚光器和物镜的数值孔径要取得一致。其意义一是：使物镜的镜接受到足够宽的入射光束，而且入射光束所展开的角度正好符合物镜的镜口角要求，以充分发挥物镜分辨力。二是把物镜所接受的光束以外的多余光线挡掉，以排除干扰。聚光器数值孔径低于物镜，那么物镜的部分数值孔径就浪费了，如果高于物镜数值孔径，一方面不能提高物镜规定的分辨力，另一方面因光不过宽使清晰度下降。聚光器与物镜配合的操作是：取下目镜，由镜筒中观察，调节聚光器光阑，使它的口径与所见视场的直径相同，即不同的物镜，聚光器光阑孔径不同。应随物镜改变及时加以调节。（应将不同物镜需聚光器光阑刻度——校正固定）。 光源：光源要安装稳压设备，亮度能调节；光束直径不能小于聚光器光阑直径，光线要均匀。 曝光测量。曝光试验：散页片：抽出暗合盖使整个胶片在照相机内不爱遮盖。以某一单位时间（取慢速时间或快速时间均可，如1秒或1/250秒）作为起始进行一次曝光。 将暗合盖推进一英寸左右，再以同样的曝光时间曝光一次。 再将暗合盖推进一英寸左右，以多于或少于上次曝光时间的两倍再曝光一次。 以后每推进一英寸，曝光增加或减少二倍连续进行若干次曝光。 接规定要求冲洗胶片，然后认真进行对比，先择一暗部与亮部的细节最丰富的一视野的曝光为“标准”曝光时间。 胶卷：其方法道理基本同散页片。取一胶卷，用不同的时间作一系列的曝光，然后认真冲洗确定最佳曝光时间。 曝光计算：“标准”曝光时间，只适用于同一显微镜，同一光学条件组合下的拍摄。但在实际拍摄中，光学条件是需要变化的，如物镜的调换等。所以要进行曝光换算。计算公式如下： 滤色片系数：滤色片系数是指滤色片吸收光量的能力的因数。在使用彩色片时则不用考虑光片系数，因为彩色摄影主要是使用色温补偿滤色片，一般是预先放入光路中的。在使用黑白片时，最好是采用白光测光法，测得的曝光时间乘以滤光片系数，即等于总曝光时间。如果预先将滤光片放入光路中，即可直接读出曝光时间，不用考虑滤色片系数。滤色片系数在滤色片使用说明中均有标明。 曝光测量方法与步骤：在显微摄影中，测量亮度或曝光时间的方法一般有两种。 将标本载玻片从载物台上移开，只读背景的亮度。这种方法有的在使用彩色反射片时使用。 测量标本图象的实际亮度，这一方法适合黑白片也适合彩色片。它能使被摄体暗处细节获得良好的表现。在显微摄影中普遍使用这种测光方法。 不管使用哪种测光方法，都必须首先校正曝光表，使与拍摄及冲洗等条件相一致。因不同厂家生产的曝光表使用方法不尽相同，故使用方法也不能完全统一，下面介绍使用曝光表的一般步骤。具体方法需遵