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紫外分光光度法测蛋白酶酶活力 美析仪器有限公司 关键词：紫外分光光度法；蛋白酶；美析仪器；UV-1700 紫外分光光度计 1、原理 蛋白酶在一定的温度与pH 条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反 应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测 定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义：每1mL 粗酶液，在一定温度和 pH 值条件下，1min 水解酪素产生 1ug 酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表 示。 2、试剂和溶液 2.1 三氯乙酸c （CCL3 ·COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解 并定容至1000 mL。 2.2 氢氧化钠溶液c （NaOH）=0.5mol/L 按GB601 配制。 2.3 盐酸溶液c （HCL）＝1 mol/L 及0.1 mol/L 1 mol/L H ＣＬ : 取 90mL 浓盐酸溶解于去离子水中，定容至 1000mL。 0.1 mol/L H ＣＬ：取 9mL 浓盐酸溶解于去离子水中，定容至 1000mL。 2.4 缓冲溶液 a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4 ·12H2O）6.02g 和磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·12H2O）0.5g， 加水溶解并定容至1000mL。 b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液 称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至 1000 mL。 乙 液 称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液 取甲液 8 mL，加乙液 1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L 乳酸缓冲溶液。 c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液 称 取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液 取甲液500 mL、乙液400 mL 混匀，用水稀释至1000mL。 上述 各种缓冲溶液，均须用pH 计校正。 2.5 10g/L 酪素溶液称取酪素 1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L 氢 氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3 滴）湿润后，加入适量的各种适宜 pH 的缓冲溶液约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后， 转入100 mL 容量瓶中，用适宜的ｐH 缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮 存，有效期为三天。 2.6 100ug/mL L－酪氨酸标准溶液 a、称取预先于 105℃干燥至恒重的 L－酪氨酸 0.1000g，精确至 0.0002g，用 1mol/L 盐酸60 mL 溶解后定容至100 mL，即为1mg/mL 酪氨酸标准溶液。 b、吸取1mg/ mL 酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L 盐酸定容至100 mL， 即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 3 仪器和设备 3.1 恒温水浴40±0.2℃。 3.2 美析紫外分光光度计UV-1700。 4 分析步骤 4.1 求K 值 按下表配制不同浓度的 L－酪氨酸标准溶液，然后，直接用紫外分光光度计于 275nm 测定其吸光度（A），以吸光度A 为纵坐标，酪氨酸的浓度c 为横坐标，绘 制标准曲线（此线应通过零点）, 根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K 值; （其K 值应在（130～135）范围 内）。 管 号 酪氨酸标准溶液的浓 度 （μg/mL） 取100ug/mL 酪氨酸标准溶液的体积 mL 取水的体积 mL 吸 光 值 Abs. 0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 4.2 测定 吸取适量稀释的酶液2.00mL、酪素2.00