二质粒(plasmid).ppt

质粒复制的调控机制 07级细胞专业 周鹏 主要内容 质粒的自主??复制性 质粒复制的调控机制 质粒不相容性(inc, incompatibility) 质粒(plasmid) 质粒是能独立于寄主染色体而自主复制并被稳定遗传的一类核酸分子 绝大多数的质粒是DNA型 目前已知只有酵母杀伤质粒(killer plasmid)是RNA型 绝大多数的天然DNA质粒为共价、闭合、环状的分子结构，即cccDNA (covalently close circular DNA ) 质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb 一 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制,并赋 予宿主细胞特定的遗传性状. 质粒DNA的复制方式: 主要有“θ”型复制和滚环复制 根据在每个细胞中拷贝数的多寡，质粒可分为两大复制类型： ① 严紧型质粒(Stringent plasmid) ② 松弛型质粒(Relaxed plasmid) 一种质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并不是绝对的，同一质粒在不同的宿主细胞中可能具有不同的复制型，这说明质粒的复制不仅受自身的制约，同时还受到宿主的控制，同宿主的状况有关。 二 质粒复制的调控机制 现在已知的复制控制方式主要有三类: ⑴ 单一元件控制; ⑵ 主、辅元件控制; ⑶ 2 种控制元件协同作用。 依所用负控制元件的类型不同, 质粒复制的控制系统主要有: ⑴ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation) ⑵ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation) ① 反义RNA单独控制 ② 反义RNA 与转录阻遏蛋白共同控制 ⒈ 重复子结合调控 (iteron-binding regulation) 在含重复子的质粒复制起点(ori) 中, 有一富AT 区和多个重复序列(重复子) , 质粒编码的复制起始蛋白Rep 能以有序的方式与重复子序列结合, 起到控制质粒拷贝数的作用。 在上述模式中,Rep蛋白结合在复制起始区及其附近的重复序列上,对复制起始起着正调节作用,同时对其自身的表达起负调节作用。 Regulation of plasmid copy number by iterons: 空间位阻模型 空间位阻模型认为, 决定质粒复制率的主要因素是重复子的浓度而不是Rep 蛋白的表达水平。当质粒拷贝数较低时, Rep蛋白与重复子结合并饱和, 促发复制起始; 随着质粒拷贝数的增加, 结合于某一起点重复子的Rep 分子, 开始与结合于另一起点重复子的Rep 分子相互作用, 并通过Rep- Rep 相互作用把2个环状质粒分子偶联起来, 形成“手铐”状的复合物, 导致这2个重复子区域之间出现空间位阻而阻断复制的起始。 在随后的细胞生长期间, 这种质粒对也逐渐分离, 使各质粒分子的复制起始潜力得以恢复。 ⒉ 抑制物-靶位调控 (ihibitor-target regulation) 在这一模式中,由质粒编码的抑制因子(反义RNA)结合在复制起始区的特定靶位点上,对复制起负调控作用。 反义RNA : 小RNA 分子, 长35～150 nt, 有1～4个茎-环( stem-loop) , 其序列与靶转录物 5 端的一个区域互补, 又称反转录RNA( countertranscribed RNA, ctRNA) 反义RNA的作用方式主要有以下两种: ⑴ 抑制引物RNA 加工 (以ColE1质粒为例来说明) ⑵ 抑制前导肽翻译 (以R1质粒为例来说明) ⑴抑制引物RNA 加工 ColE1 质粒的复制起始由一长为700 nt 的转录物RNAⅡ(preprimer)引发。RNAⅡ由宿主RNA 聚合酶合成, 经构象变化后, 与模板DNA在复制起始区附近偶联(coupling)形成RNAⅡ-DNA杂交物, RNase H切割其中的RNA 部分, 产生游离的3‘ - OH, 再在DNA 聚合酶Ⅰ的作用下, 从这个游离的3’ - OH开始DNA前导链的合成。 3‘ - OH的生成是复制起始的限速步骤, 受反义RNA(RNAⅠ)调控。RNAⅠ序列与RNAⅡ的前108 碱基序列完全互补, 互补区结合