技术咨询电话：400-607-9999 胶原蛋白酶2,9检测 mmp zymography .doc

胶原蛋白酶2,9检测MMP Zymography assay kit 货号：M100010 描述：基质金属蛋白酶(MMP)以无活性的酶原形式分泌，活化后降解细胞外基质的胶原蛋白，又称胶原酶。通过影响细胞外基质，胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理生理过程、临床诊断和治疗中的意义日益受到重视 1。 本试剂盒提供全套试剂，用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一种广为使用的、基于SDS电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法 2。其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9特异蛋白底物及酶学反应缓冲液，并提供MMP-2、MMP-9阳性对照物；同时采用无毒、极其灵敏的单步染色方法，在10分钟之内一步完成凝胶酶学显色，大大缩短了经典的长时间染色和脱色时间。可检测少至0.1~0.5 μl血液中的MMP-2、MMP-9酶谱及活性，检测灵敏度~1 nM。 试剂盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。 用途检测MMP-2、MMP-9酶谱及活性。Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM 组成与储存 (50 assays) 1. 2 × SDSnon-reducing buffer 1.5 ml , ?20 oC 2. positive mixture（取人、小鼠、大鼠或兔100ul全血自制） 3. 20 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC 4. 10 × Buffer A（wash buffer）, 50 ml, 4 oC 5. 10 × Buffer B( incubation buffer), 50 ml, 4 oC 6. SDS凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液, 4 oC 检测步骤 制备含MMP底物蛋白SDS凝胶：推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS凝胶。将20 × substrate融化，并90 oC加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20 × substrate并使之稀释20倍，混匀，然后再加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。 阳性对照及待检测样品的前处理及上样：阳性对照：取人、小鼠、大鼠或兔100ul全血与100ul2 × SDSnon-reducing buffer等体积混合。待测样品则1:1稀释于2 × SDSnon-reducing buffer (可自行配制 2 ×：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。要点是切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可预试验确定加样量。应该加蛋白Marker。 电泳：低电流恒流电泳，每一个小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。 洗涤凝胶：取出凝胶，去除压缩胶。放入容器内，可先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入5ml 1× Buffer A，室温漂洗凝胶2 × 15分钟。中间换液。 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B，室温或37oC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37oC孵育1小时即可显示。如MMP活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜，注意防止液体蒸发。 显色：倒掉Buffer B。加入SDS凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（详细步骤见SDS凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示并尽量设置黑色。MMP条带则为白色。这种背景黑条带白的格式是大量已发表的英文论文中最常见的格式。 说明 10 mM EDTA完全抑制MPP活性。 凝胶干燥：可使用聚丙烯酰胺凝胶干胶装置