重组乙肝疫苗(cho细胞).docVIP

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞) Chongzu Yixing Ganyan Yimiao(CHO Xibao ) Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant DNA Techniques in CHO Cell 本品系由重组CHO细胞表达的乙型肝炎(简称乙肝)病毒表面抗原 (HBsAg) 经培养、纯化, 加入氢氧化铝佐剂后制成, 用于预防乙型肝炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物应符合“凡例”有关要求。 2 制造 2.1 生产用细胞 2.1.1 细胞名称及来源 生产用细胞为DNA重组技术获得的表达HBsAg的CHO细胞C28株。 2.1.2 细胞库的建立及传代 应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 C28株主细胞库的传代应不超过第21代，工作细胞库应不超过第26代，生产疫苗的最终细胞代次应不超过第33代。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库的检定 应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.3.1 细胞外源因子检查 无菌、支原体、细胞病毒外源因子检查均应符合规定。 2.1.3.2 细胞鉴别试验 应用同功酶分析、生物化学方法、免疫学、细胞学和遗传标记物等任何方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。 2.1.3.2.1 细胞染色体检查 用染色体分析法进行检测， 染色体应为20条。 2.1.3.2.2 目的蛋白鉴别 采用ELISA检测， 应证明为HBsAg。 2.1.3.3 HBsAg表达量 主细胞库及工作细胞库细胞HBsAg表达量应不低于原始细胞库的表达量。 2.1.4 保存 细胞种子应保存于液氮中。 2．2 原液 2.2.1 细胞制备 取工作细胞库细胞， 复苏培养后， 经胰蛋白酶消化, 置适宜条件下培养。 2.2.2 培养液 培养液为含有适量灭能新生牛血清的DMEM液。新生牛血清的质量应符合规定（附录XIII D）。 2.2.3 细胞收获 培养适宜天数后， 弃去培养液， 换维持液继续培养适1－2天后，当细胞表达HBsAg达到1.0 mg/L以上时收获。维持液为含适量新生牛血清的DMEM液或其他适宜培养液。 根据细胞生长情况， 可换以维持液进行多次收获。应按规定的收获次数进行收获。每次收获物应逐瓶进行无菌检查。每次收获物如出现单瓶细胞污染，则与该培养瓶有关的任何一次收获物不得用于生产。收获物应于2－8℃保存。 2.3.4 收获物合并 来源于同一细胞批的收获物经无菌检查合格后可进行合并。 2.3．5 纯化 合并的收获物经澄清过滤， 采用柱色谱法进行纯化， 脱盐， 除菌过滤后即为纯化产物。 2.3.6纯化产物检定 按3.1项进行。 2.3.7 纯化产物保存 于2－8℃保存不超过3个月。 2.3.8 纯化产物合并 同一细胞批来源的HBsAg纯化产物检定合格后， 经0.22μm除菌过滤后可合并为1批原液。 2.3.9 甲醛处理 合并后的 HBsAg纯化产物中加入终浓度为200μg/ml的甲醛，置37℃保温72小时。 2.3.10 除菌过滤 甲醛处理后的HBsAg经超滤、浓缩、除菌过滤后即为原液。（亦可在甲醛处理前进行除菌过滤。） 2. 3. 11 原液检定 按3.2项进行。 2. 4 半成品 2．4．1 配制 根据原液蛋白质含量进行稀释，使HBsAg的最终含量为10 μg/ml或20 μg/ml。加入氢氧化铝佐剂吸附后，可加入适量硫柳汞作为防腐剂，即为半成品。 2. 4．2 半成品检定 按3.3项进行。 2. 5 成品 2.5．1 分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.5.2 分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.5.3 规格 每瓶0.5ml或1.0 ml。每1次人用剂量为0.5ml，含HBsAg 10 μg； 每1次人用剂量为0.5ml或1.0 ml， 含HBsAg 10 μg或20 μg。 2.5.4 包装 符合“生物制品包装规程”规定。 3 检定 3.1 纯化产物检定 3.1.1 蛋白质含量 应不高于200μg/ml（附录VI B 第二法）。 3.1.2 特异蛋白带 依法检查（附录IV C），SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度15%，浓缩胶浓度5%，上样量5μg，银染法凝胶染色。在分离胶中应有分子量23kD、27kD蛋白带，可以有30kD蛋白带及HBsAg二聚体蛋白带。 3.1.3 纯度 采用高压液相色谱法（附录 Ⅲ B）测定，用SEC-HPLC法：亲水树脂体积排阻色谱柱，排阻1000 kD，孔径100，粒度17μm，直径7.5mm,长30cm；流动相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.8；用波长280nm检测。按面积归一化法计算乙型肝炎表面抗原纯度，应不低于95.0%。 3.1.